基于miRNA调控的光控莱茵衣藻持续产氢体系的研究

The hydrogen production from green algae is the most promising way according to the assessment by the International Energy Agency. However, the main problem of developing industry of hydrogen production from green algae is the inhibition of hydrogenase activity by oxygen, which results in the releasing of hydrogen from algal cells continues for only a few seconds to a few minutes. Expression of related artificial miRNA could extend the time of sustainable hydrogen production in Chlamydomonas reinhardtii. But the heat treatment is harmful to algae cells and inconvenient in massive culture. This project plans to explore and optimize a new method of sustainable hydrogen production in C. reinhardtii by regulating miRNAs expression levels using light-mediated (blue light) expression system. (1) Hydrogen biosynthesis related miRNAs are obtained from high throughput sequencing. The mechanism of miRNAs regulating hydrogen production will be explored by predicting and verifying their target genes. (2) Photoactivatable gene expression system has been established using light receptors and their interaction proteins, and will be optimized. (3) Sustainable hydrogen production algal strains will be obtained by light activation of related miRNAs in alga cells. We have established a photoactivatable expression system in eukaryotic photosynthetic organisms for the first time. This project of sustainable hydrogen production via reversible regulating miRNAs will develop a deeper understanding of the regulation mechanism of hydrogen production in green algae, and provide applicable technological approaches of a more convenient and efficient sustainable hydrogen production system in green algae.

绿藻光合制氢被国际能源组织评为最具前景的生物制氢技术之一，其发展瓶颈是氢酶的氧抑制，这使绿藻持续放氢时间只有几秒到几分钟，而热激诱导表达miRNA可以抑制衣藻光合放氧反应，延长其持续放氢时间。然而热激会抑制藻细胞生长，且不能快速可逆调控，难以达到大规模应用的需求。本项目拟利用光控开关（蓝光）构建并优化基于光控miRNA的衣藻连续光合制氢系统。本项目计划（1）通过高通量测序筛选更多参与产氢调控的miRNA，对其靶基因进行预测和验证，探索miRNA调控产氢的机制；（2）项目前期已通过在衣藻中表达光受体蛋白及其互作蛋白，构建了衣藻外源基因光控表达系统，本项目计划进一步优化该系统；（3）利用光控系统表达产氢相关的miRNA，获得持续产氢藻株。本项目将通过在真核光合生物中建立的光控外源基因表达系统来调控miRNA表达以延长绿藻持续产氢时间，将为绿藻光合制氢的产业化应用提供理论基础与新的应用技术途径。

绿藻可以利用太阳光能生长，氢酶效率高，又有高附加值的藻类副产品，因此绿藻光合产氢被认为是有应用潜力的制氢方式。但是绿藻的铁氢酶对氧气非常敏感，其活性会受到氧分子的抑制；而缺硫培养可以打破这种抑制，使绿藻持续产氢。本项目在前期工作的基础上，分析了缺硫培养前后的莱茵衣藻miRNA组和lncRNA组的变化，从中筛选可能调控产氢的因子。我们使用不同的工具进行预测，共获得了310个miRNA的靶基因，并对靶基因进行了比对和分析。结果发现衣藻miRNA靶基因的预测结果在不同工具中差异巨大。我们筛选了4个缺硫培养后表达水平下调的miRNA，并构建了它们对应的STTM转基因藻株，STTM是可以抑制miRNA表达水平的工具。在这4个目标miRNA中，有3个我们都获得了的多个转基因株系，只有miRn077仅获得了1个转基因株系，我们最终共选定了10个转基因株系，并验证了STTM的效果。结果表明STTM在莱茵衣藻中可以有效抑制目标miRNA的表达，但同时这种对miRNA的抑制是非特异性的，也严重影响非目标miRNA的表达，这点与高等植物大不相同。我们还探究了高产氢转基因藻株miR1166.1影响产氢的机制，使用不同技术验证了10个miR1166.1的预测靶基因及miR1166.1对其作用方式，我们认为miR1166.1可能通过影响衣藻的淀粉代谢来调控光合产氢。由于在研究中我们发现了衣藻miRNA的特殊性和靶基因预测的不准确性的科学问题，我们还探索了miRNA在各大生物类群中的特点和进化趋势。另外我们初步探索了除miRNA之外的另一种起调控作用的非编码RNA——lncRNA，寻找了可能调控产氢的lncRNA并构建转基因株系用于验证。本项目共发表了标注项目资助的论文两篇，分属于中科院JCR大类一区、TOP期刊和JCR大类二区；申请了中国发明专利一项，目前是初审状态；项目成员参加了4次国内会议，并做了1次口头报告；培养了硕士研究生4人，已有1人获得理学硕士学位。计划后继会继续有标注本项目的相关成果产出。