修复毒性甲基化基团的AlkB加双氧酶蛋白家族功能的研究

DNA易受到内源和外源性烷基化剂导致的具有潜在诱变和细胞毒性的DNA碱基修饰， 从而干扰DNA合成。烷基化剂是一把双刃剑，可以导致癌症，也可促使肿瘤细胞死亡，但也带来靶细胞的抗药性问题。降解毒性甲基化基团的AlkB蛋白和其同源蛋白加双氧酶，对修复毒性DNA 碱基修饰，维持基因组稳定性和抑制细胞癌变起着至关重要的作用。其酶活性依赖于铁离子和2-酮戊二酸。哺乳动物基因组编码8种高度保守的AlkB同源蛋白(ABH1-ABH8)，也包括肥胖相关基因FTO。ABH1-3和FTO已被证明具有类似AlkB的修复能力，但ABH4-8蛋白的功能仍然未知。本项目综合利用现代生物学方法,涉及功能基因组学、蛋白质组学和转基因技术，研究和鉴定AlkB加双氧酶蛋白家族维持细胞基因组的稳定性，以及细胞的衰老和癌变的分子机理，为肿瘤放化疗的辅助治疗提供潜在的作用靶点，对开发联合用药以及临床治疗用药都有着重要的指导意义。

AlkB加双氧酶作为DNA去甲基化酶，在修复毒性DNA烷基化损伤，维持基因组稳定性方面起着至关重要的作用。但是作为AlkB的人类同源基因，ALKBH4-8的功能却鲜有人知，为此，我们拟综合利用包括细胞生物学，分子生物学，基因组学和化学生物学等方法，鉴定各种酶的去甲基化底物，研究其生物学功能及相关的生理病理效应，以最终能够找到肿瘤等重大疾病的诊断、治疗的作用靶点。.最初我们克隆了五种基因的cDNA, 分别建立了其原核与真核表达系统。利用原核表达系统，我们成功表达了ALKBH4，5蛋白并且以之为抗原，制备了能够用于免疫荧光染色及蛋白印迹的兔源抗体。利用真核细胞表达系统，我们研究了ALKBH5的细胞定位以及相关的生物学功能。我们发现ALKBH5主要定位于细胞核，尤其是细胞的核仁与speckle区域。通过体外生化实验，我们发现ALKBH5同时对DNA和RNA的N6-甲基腺嘌呤有去甲基化作用。鉴于目前并没有在人类基因组DNA中检测到N6-甲基腺嘌呤的存在，因此我们便着重研究了ALKBH5作为RNA中N6-甲基腺嘌呤去甲基化酶的生物学功能。与其在speckle的定位相对应，我们发现ALKBH5通过N6-甲基腺嘌呤去甲基化参与RNA的代谢调控；利用小鼠动物模型，我们发现ALKBH5基因敲除的雄性小鼠有精子发育异常，生育率降低等表型出现；而且生精小管中mRNA呈现出明显增高的m6A甲基化水平。这说明ALKBH5通过对mRNA的m6A去甲基化参与调控精子发育等生理过程，这将对临床上研究不育症的发病机制，寻找相应的早期诊断标记物及研发对应的治疗方法有重要的理论指导意义。.另外，我们的研究结果发现了迄今为止第二个RNA去甲基化酶，进一步证实了RNA甲基化是一个动态的可调节修饰方式，并且具有重要的生物学功能，并由此推动以m6A为代表的RNA表观遗传研究领域的进展。