脂肪酸酰化位置质谱分析及酶促酯交换反应位置选择性机理研究

甘油三酯中脂肪酸酰化位置分布对食用油脂的物理化学性质和营养特性有着极为重要的影响。酶促酯交换是改善甘油三酯组成及其脂肪酸酰化位置分布，生产有利于人体健康专用油脂、功能油脂的重要方法。本项目研究HPLC-MS/MS方法高效、高通量地分析甘油三酸酯上酰化脂肪酸位置分布分析方法，能克服传统分析方法费时费力、操作步骤复杂、需要较多样品量等不足，适于大规模筛选优化酶促反应条件，揭示酶促酯交换等脂肪酶酶促反应的脂肪酸位置选择性机理。本项目拟选用富含多不饱和脂肪酸的微生物油为底物，研究脂肪酶种类、反应条件等因素对酶促酯交换的脂肪酸酰化位置选择性的影响，并揭示其机理，进而进行定向酶法改性，制备结构功能脂质的研究。本项目建立的方法能成为微生物油脂等实际样品脂肪酸酰化位置分析检测的重要手段。研究油脂定向酶法改性中脂肪酸酰化位置选择性机理，为专用油脂、功能油脂和结构脂质产品的研发提供理论依据。

项目背景及意义：甘油三酯的 “脂肪酸酰化位置效应”对于食用油营养价值以及结构脂的研发有着重要意义。建立高通量、高准确性的甘油三酯（TAG）脂肪酸酰化位置剖析方法是开展酶促反应脂肪酸酰化位置选择性研究的关键，是新型功能结构脂研发的前提，将其应用于大规模筛选优化酶促反应条件，揭示脂肪酶酶促反应的脂肪酸位置选择性机理，可为专用油脂、功能油脂和结构脂质研发提供理论依据。圆满完成项目各项技术指标，获得国家发明专利授权2项，发表论文14篇（其中SCI收录论文8篇），培养研究生10名。.研究内容：1、研究高效的TAG结构剖析方法；2、研究脂肪酶种类、反应条件等因素对酶促酯交换的脂肪酸酰化位置选择性的影响，并揭示其机理，并开展定向酶法改性，制备结构功能脂质。.重要结果：1、高效、高通量的TAGs结构剖析与鉴定的方法研究：（1）结合固相萃取和气相色谱联用技术，建立了结构脂中α、β位置脂肪酸及甘油酯组成的分析方法。对比传统TLC分析，该方法操作简便，可批量处理样品，同时可以避免样品长期暴露于空气中，尤其适合作为常温下易氧化且富含长链多不饱和脂肪酸结构脂的分析。（2）研究了混合模式色谱模式，建立了单柱二维液相色谱质谱高效分析TAG的方法；与传统一维色谱技术相比，该方法可以提高检测通量5倍，提高检测灵敏度10倍以上。该方法选择性高、峰容量大、分析速度快，实现了TAGs高效快速的分离鉴定和定量检测。.2、酶促交换反应甘油酯酰化位置立体选择性机制研究：(1)以实验室纯化的花生四烯酸（ARA纯度＞93%）为原料，系统考察酶促反应时间、反应温度、底物摩尔比及酶添加量对1,3-甘油二酯产率的影响。在最优条件下，1,3-甘油二酯的相对百分含量可达73.5%，其中1,3- ARA-甘油二酯含量为38.1%。 （2）本研究采用超声预处理方法能够显著提高产物中OPO的含量。优化了超声预处理酶法合成OPO型结构脂的反应条件。较全面地考察了超声预处理条件下OPO型结构脂的合成及实时监测反应产物酰基转移机制，研究了不同条件下酶法合成OPO型母乳化结构脂质的动力学模型。(3)本研究以实验室纯化制备的ARA乙酯为原料，通过单因素及响应面分析实验优化酶法合成APA型结构脂的工艺，研究了反应产物中sn-2位发生的酰基转移反应。合成的APA型结构脂在sn-2位含有较高的棕榈酸，ARA在sn-1,3位具有较高的插入率