杀虫剂对小菜蛾泛素化蛋白质组的胁迫诱导及其功能分析

昆虫对杀虫剂的抗药性是由人类活动引起的最广泛的遗传变异之一，了解杀虫剂作用下昆虫细胞内的化学和生理变化，是有效预防和治理害虫抗药性的关键。本课题以室内培育的小菜蛾对溴氰菊酯的高抗品系和同步隔离饲养的敏感品系为材料，在发现了抗性品系和敏感品系中存在泛素基因差异和蛋白质组差异的前期工作基础上，克隆泛素基因家族，富集分离在两种品系中差异表达的泛素化蛋白质，分析泛素基因变化对蛋白质泛素化的影响以及药剂选择作用下泛素化蛋白质组的变化，通过RNAi、连锁不平衡和关联分析，探讨在杀虫剂胁迫下产生的生化指标与抗药性的关系，筛选抗性分子标记，为种群抗性水平监测、抗性风险评估、合理选择控制害虫的杀虫剂等提供理论基础和技术手段。

小菜蛾(Plutella xylostella L.)是世界性的十字花科蔬菜的主要害虫，对几乎所有的合成杀虫剂均产生了抗药性，已成为虫害防治工作中的一大障碍。发现和研究抗药性相关基因将有助于阐明抗药性的分子基础和寻找治理抗性的靶标。.采用cDNA代表性差异分析方法，我们发现泛素基因在小菜蛾的溴氰菊酯抗性品系和敏感品系中的表达水平具有明显差异。在此研究的基础上，本课题以小菜蛾四龄幼虫为实验材料，克隆了小菜蛾泛素基因家族各成员的基因序列，通过活体水平的RNA干扰和细胞水平的过表达，分析了泛素基因与溴氰菊酯抗药性的关系。并且采用非标记蛋白定量组学LC MS/MS方法对溴氰菊酯抗性品系和敏感品系小菜蛾幼虫的泛素化蛋白质组进行了比较与分析。主要研究结果如下：.1．小菜蛾UBL40的开放阅读框为387 bp，编码128个氨基酸残基。第1至228个核苷酸编码泛素蛋白（76个氨基酸），第229到387个核苷酸编码核糖体蛋白L40（52个氨基酸）；UBS27a的开放阅读框为468 bp, 编码155个氨基酸残基。前76个氨基酸为泛素蛋白，后79个氨基酸为核糖体蛋白S27a；多聚泛素polyubiquitin由泛素重复单位以首尾相接的形式表达。.2．RNA干扰UBL40后，与对照组相比，小菜蛾对溴氰菊酯的抗药性水平显著下降；UBL40转染果蝇Kc细胞，用CCK-8试剂盒检测UBL40过表达情况下细胞对溴氰菊酯的耐受水平。结果发现，在溴氰菊酯胁迫下，UBL40转染组细胞的存活率明显升高。.3. 利用多聚泛素亲和磁珠对细胞中的泛素化蛋白进行亲和富集以及1D SDS-PAGE分离和质谱鉴定，在小菜蛾抗溴氰菊酯品系和敏感品系共筛选出26个差异表达的泛素化蛋白，其中显著差异蛋白总数为22个，显著上调蛋白为17个，显著下调蛋白为5个。.4. 功能分析结果表明，这些差异表达的泛素化蛋白主要包括碳酸酐酶、核糖基化因子、二氢硫辛酰胺脱氢酶、热激蛋白等。这些蛋白涉及蛋白结合、细胞骨架构建、酶抑制活性等多种分子功能。. 上述结果表明，（1）UBL40与小菜蛾对溴氰菊酯的抗性相关；（2）溴氰菊酯的长期胁迫引起了小菜蛾泛素化蛋白质组的表达变化。本研究首次发现泛素延伸蛋白UBL40与昆虫抗药性相关，为进一步阐明杀虫剂抗性的分子机制提供了新的科学依据，具有重要的理论意义和潜在的实际应用价值。