PARP1和miR-223负反馈调控环介导的miR-223/PARP1/H-RAS通路异常在氢醌诱发癌变中的作用及分子机制

PARP1, miR-223 and H-RAS, critical therapeutic targets in tumor clinical treatment, play important roles in cell differentiation, proliferation and apoptosis, and are verified to be associated with tumor. Based on previous study, this project will test the expressions of PARP1, miR-223 and H-RAS dynamicly in hydroquinone induced malignant transformation cells, to establish miR-223/PARP1/H-RAS pathway which mediated by a negative regulatory loop composed by PARP1 and miR-223. Using RNA interference, PARP inhibitors and inducer, ChIP and luciferase report assay to identify the mechanism of miR-223 and H-RAS mediated by PARP1 in vitro, in the versus, illustrate the mechanism of PARP1 mediated by miR-223 through miR-223 expression vector and luciferase report assay. Uncover the biological functions of aberrant miR-223/PARP1/H-RAS pathway both in vivo and in vitro. It would be the first time to demonstrate the function and molecular mechanism of aberrant miR-223/PARP1/H-RAS pathway mediated by the negative feedback composed by miR-223 and PARP1 in the hydroquinone induced tumor formation course，making new direction for the mechanism of environmental carcinogenesis.

PARP1、miR-223和H-RAS是肿瘤临床治疗的核心靶点，在细胞分化、增殖和凋亡等过程中起重要作用，已证实其异常表达与肿瘤有关。本项目拟在前期研究基础上以苯代谢物氢醌诱发恶变细胞为模型，动态分析PARP1、miR-223和H-RAS表达，初步建立PARP1与miR-223负反馈调控环及其介导的miR-223/PARP1/H-RAS通路。在细胞内，以RNA干扰、PARP抑制剂与诱导剂、ChIP和报告基因研究PARP1调节miR-223和H-RAS的机制，以miR-223表达载体和报告基因研究阐明miR-223调节PARP1机制；在细胞和动物体内，揭示miR-223/PARP1/H-RAS通路异常的生物学功能。本项目将首次揭示PARP1与miR-223负反馈调控环介导的miR-223/PARP1/H-RAS通路异常在氢醌诱癌过程中的作用及分子机制，为阐明环境致癌机制及其防治提供新思路。

1.背景.氢醌（HQ）是苯的重要代谢产物之一，是苯的常用体外研究替代物。PARP-1催化PARylation反应，进而发挥其众多的生物学功能。PARP-1在维持基因组稳定、DNA损伤修复、细胞凋亡、细胞增殖、基因转录后修饰和肿瘤发生等过程中起重要作用。.2.重要结果、关键数据.2.1 PARP-1调控H-RAS参与细胞周期调节和细胞恶性转化.在建立HQ诱导TK6恶性转化细胞模型中检测到PARP-1和H-RAS蛋白表达水平升高，在HQ处理模型中，PARP-1和H-RAS蛋白表达水平相一致，使用RNAi干扰和PARP抑制剂对PARP-1的表达和活力分别进行干扰后，细胞周期阻滞在G1期，CO-IP证实H-RAS被PARylation，共聚焦荧光显微镜对H-RAS蛋白的PARylation进行了进一步的验证，同时发现H-RAS蛋白能从细胞膜转移到细胞核内。.2.2 PARP-1调节miR-223参与细胞凋亡并介导HQ细胞恶性转化.在HQ恶性转化细胞和HQ处理不同时间点的TK6细胞检测了PARP-1和miR-223表达，得出PARP-1可能调控miR-223表达，mH2A和组蛋白乙酰化参与该过程。PARP-1沉默细胞miR-223、HDACs表达明显下降，但是凋亡率明显升高。.2.3 PARP-1通过PARylation调节AATF参与DNA损伤修复.HQ处理TK6细胞后，PAR、γ-H2AX、AATF的含量分别在0.5 h、3 h、6h时达到高峰。PARP-1的含量在3 h时达到最低。PARP-1沉默细胞中，HQ处理使得PARP-1、PAR和AATF的含量均下降，γ-H2AX的含量却上升了。AATF被PARylation且与PARP-1形成蛋白复合体。.2.4 PARP-1通过PARylation调节ZO-2参与细胞凋亡.HQ处理TK6细胞的凋亡率上升，但PARP-1沉默细胞凋亡率比TK6细胞低。HQ处理TK6细胞PARP-1和ZO-2蛋白均上升，但是沉默细胞的均下降，同时ATP的改变分别为上升和下降。ZO-2蛋白被PARylation并与PARP-1形成蛋白复合体。.3.科学意义.在HQ恶性转化模型中阐明了PARP-1、miR-223、H-RAS在恶性转化过程中的作用及三者的关系，PARP-1是重要的肿瘤临床治疗药物，该项目为HQ导致的肿瘤防治提供了一定的科学依据。