CsGSTs在茶叶类黄酮累积中的作用机理研究

Flavonoids in tea are about 12-25% of the dry tea leaves, which are much higher than many other plants.They are not only contributing to the attractive flavor and taste, but also for many health benefits. Previous studies were mainly focused on flavonoid biosynthesis in tea plant. Few attention was paid to their regulation and transportation. However, the later might play an important role in the accumulation of flavonoids in tea. Glutathione S-transferases (GSTs) are essential for flavonoid transportation. They belong to a large gene family and show different expression patterns and functions in different organs. Here Miseq will be applied to identify the expression of different GSTs in tea samples harvested in different seasons and cultivars.Combined with the flavonoid content data determined by HPLC-TOF/MS, we will preliminarily identify some essential GST genes associated with flavonoids accumulation. Furthermore, on the base of 7 previously identified GST genes, transgenic arabidopsis will be established to character their phenotypes. One or two key GST genes with the largest effect on flavonoid accumulation in transgenic arabidopsis will be identified and used for trangenic tea plant experiment. Finally, we will also try to establish GST overexpression E. coli system, which will help us to identify the combination specifity of the key GST to flavonoids.By combining the transgenic results and in vitro combination results, we will uncover the regulation mechanism of the key CsGST in flavonoid accumulation in tea.

茶叶类黄酮物质含量丰富（12-25%），是茶叶品质及保健功能的首要成分，因此破解茶叶富集类黄酮之谜意义重大。目前类黄酮合成途径已基本探明，但对其调控机理的研究仍较少。谷胱甘肽转移酶（GSTs）是调控类黄酮物质合成及转运的关键酶，它属于多基因家族，具有不同的表达丰度和生理功能。其中哪些GST对茶叶类黄酮物质累积起关键作用还不得而知。本研究拟在前期研究基础上，采用转录组测序进一步鉴定不同品种、不同季节茶叶中GSTs的表达与类黄酮含量变化的关联性；同时将前期获得的7个与类黄酮密切相关的GST基因转入拟南芥，筛选出对类黄酮含量影响最大的1-2个关键GST基因，并构建茶树关键GST基因过表达体系，明确其对茶叶类黄酮累积的影响。另一方面，利用DNA重组手段构建转GST基因工程菌，研究关键GST蛋白与茶叶提取类黄酮及类黄酮成分单体结合的特异性；从而揭示茶树关键GST基因在类黄酮物质累积中的作用机理。

类黄酮是植物中一类重要的次生代谢产物，对人类健康具有重要的作用。茶叶中的类黄酮物质含量丰富，远高于蔬菜和其它作物，是决定其品质和保健功能的首要成分。目前，茶叶中的类黄酮生物合成途径的主要步骤已基本探明，且与其它植物中的类黄酮合成途径相似，表明茶叶中富集类黄酮物质可能与其特殊的调控机制有关。类黄酮主要在内质网合成，含量过高不仅抑制其合成，还会对细胞产生毒害作用，因此，类黄酮从内质网到累积部位（主要是液泡）的转运可能是影响其富集的关键因素。已有研究表明，谷胱甘肽转移酶（Glutathione S-transferase ，GST）在类黄酮的转运过程具有重要作用。本研究首先通过转录组测序，筛选获得茶叶中的GSTs，并结合生物信息学分析等手段进行分类；其次将GSTs表达量与类黄酮含量进行相关性分析，获得候选GSTs，克隆其全长cDNA序列，通过qRT-PCR（Quantitative Real-time PCR）技术研究其表达规律；最后将克隆的GST基因转入模式植物拟南芥中进行功能验证。主要研究结果如下：.1. 基于中黄2号、龙井43在对照和遮荫处理下的转录组测序，和不同发育时期与部位的龙井43茶籽苗的转录组测序，筛选获得35个GSTs基因，可分为8个亚家族：GSTU（17），GSTF（6）、GSTT（4）、GSTZ（2）、GSTL（2）、DHAR（2）、TCHQD（1）与MAPEG（1）。.2. 通过对龙井43茶籽苗3个发育阶段的根、茎、叶的类黄酮含量测定，与GSTs表达量进行相关性分析，筛选获得5个与类黄酮含量显著正相关的GSTs，分别为CsGSTF12, CsGSTF11, CsGSTL2, CsGSTU17, CsDHAR1。.3.克隆了CsGSTF12基因并进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明，CsGSTF12基因序列全长为642bp，且序列与其它花青素转运相关GSTs的相似度较高，具有高度的保守性；龙井43和紫娟不同叶位的CsGSTF12表达量与花青素含量也达到了极显著正相关，进一步证实了该基因在花青素累积中的重要性。.4. 将CsGSTF12基因转入拟南芥突变体tt19-8，获得转基因过表达株系。2%蔗糖处理下，发现该基因不仅可以弥补tt19-8突变体花青素缺失的表型，同时还影响拟南芥中的花青素含量和类黄酮组分的分配。