传统发酵豆豉中α-葡萄糖苷酶抑制剂生物合成机制研究

含α-葡萄糖苷酶抑制剂的食品对降低糖尿病患者血糖水平具有重要作用。中国传统发酵豆豉具有强α-葡萄糖苷酶抑制活性，但其活性因子的形成机制尚不明确。本项目拟选择影响豆豉α-葡萄糖苷酶抑制活性的关键微生物，通过研究其代谢产物合成途径阐释豆豉中α-葡萄糖苷酶抑制剂的形成机制。采用基因组改组技术构建α-葡萄糖苷酶抑制剂高产菌株；运用色谱分离技术及波谱学方法确定α-葡萄糖苷酶抑制剂单体构型；通过聚类分析法、液质联用及同位素标记等方法分析α-葡萄糖苷酶抑制剂单体与前体、中间体的结构相关性，探讨α-葡萄糖苷酶抑制剂的生物合成途径。本项目的成功实施可望阐明豆豉中微生物代谢产物与其降血糖活性的关系，揭示豆豉在糖尿病治疗中的作用机制，为豆豉作为降血糖功能食品提供基础理论数据，为加快传统发酵食品技术更新及进步奠定科学基础，同时为减轻糖尿病患者及整个社会的经济负担作出贡献，具有重要科学价值和社会意义。

本项目以Bacillus subtilis B2为出发菌株，采用离子诱变、紫外诱变及化学剂诱变的方法进行诱变育种并进行基因组重排实验。经改良的菌株其α-葡萄糖苷酶抑制活性比Bacillus subtilis B2提高2倍，且遗传稳定性较高。在菌株构建的基础上对诱变株的发酵条件进行了优化，在单因素发酵条件的基础上，采用四因子二次通用旋转组合设计安排31次试验，得到底物浓度、发酵温度、pH值、发酵时间对提高发酵液α-葡萄糖苷酶抑制活性影响的数学模型，进行主效应和交互作用（响应面和等值线）分析。而后利用理想点法，构造包含各个指标的数学模型，优化数学模型，得到B.subtilis B2诱变株最优的发酵条件，其最佳参数组合为：发酵时间为65h，发酵温度为39℃，底物浓度为4.5%，初始pH值为7.1，此时α-葡萄糖苷酶抑制活性为30.1。对最优组合进行试验验证，理论值与试验值相对误差较小，小于5%，拟合较好。.经过乙醇沉淀及透析分离的样品采用活性炭柱层析、Hitrap sepharose CM弱阳离子交换层析、制备型TLC分离及SephadexTM LH-20 凝胶柱层析获得α-葡萄糖苷酶抑制剂单一组分，进一步采用质谱分析得知单一组分分子量为411Da，将母离子m/z412进一步逐级裂解，分别得到II，III，IV，V中的离子碎片。其中IV中的离子m/z为163，与P2同，V中也得到m/z146.1的碎片，与P2的裂解片段相同，从离子碎片的信息，我们推断m/z为412的组分P1可能是组分P2的衍生物，即1-脱氧野尻霉素的衍生物。.选择多种常规碳源作为Bacillus subtilis B2突变体的单一碳源进行发酵，测定发酵液的α-葡萄糖苷酶抑制活性，研究结果表明Bacillus subtilis B2突变体将半乳糖转化为α-葡萄糖苷酶抑制剂的能力最强，其次是具有半乳糖结构单元的乳糖，证明半乳糖为α-葡萄糖苷酶抑制剂生物合成高效前体物质。在研究α-葡萄糖苷酶抑制剂合成前体的实验中，本研究意外发现当体系中存在葡萄糖氧化酶时，α-葡萄糖苷酶抑制剂的合成会受到影响，葡萄糖氧化酶的存在会降低α-葡萄糖苷酶抑制剂的合成量。.至项目结题，已撰写并发表研究论文7篇，其中SCI收录1篇；EI收录3篇；核心期刊论文3篇；申请国家专利2项；发表会议论文摘要1篇。