大豆抗原蛋白β-Conglycinin及其抗酶解肽对仔猪肠上皮细胞屏障功能损伤的研究

大豆抗原蛋白β-Conglycinin及其抗酶解肽，是引起仔猪过敏的重要致敏原，它们对肠上皮细胞增生、凋亡及迁移有显著影响，使肠上皮细胞屏障功能受损，本项目特为探究此致敏原对仔猪肠上皮细胞损伤前后屏障功能的变化。通过致敏原刺激细胞，检测跨上皮细胞电阻（TEER）和荧光黄透过率，明确肠上皮细胞通透性的变化；采用免疫荧光法和Western Blot法，检测紧密连接蛋白和粘着连接蛋白在细胞中的分布及含量；采用实时定量PCR技术，检测细胞中紧密连接蛋白ZO-1和occludin mRNA相对表达量；采用竞争ELISA法，检测大豆抗原β-Conglycinin及其抗酶解肽通过上皮细胞的数量。本项目将阐明此致敏原对仔猪肠上皮细胞通透性改变的相关机制，并确定细胞通透性改变与致敏原通过细胞数量之间的关系，为进一步明确大豆抗原跨上皮细胞的信号转导提供依据，进而为揭示大豆抗原致敏机理服务。

本项目选取大豆抗原蛋白β-Conglycinin及其酶解肽为致敏原，以仔猪小肠上皮细胞为模型，通过致敏原刺激细胞，检测跨上皮细胞电阻（TEER）和细胞活力（MTT）值，明确肠上皮细胞通透性的变化。结果发现25+30ku混合酶解肽对细胞的破坏程度最强，52ku酶解肽次之，并呈时间-剂量依赖性下降趋势（P<0.05）。为了进一步验证致敏原对仔猪肠上皮细胞通透性改变的相关机制，采用免疫荧光法、Western Blot法和实时定量PCR技术，检测紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin、Claudin-3和Claudin-4）及其mRNA在细胞中的分布及相对表达量；结果发现致敏原刺激细胞后细胞紧密连接处荧光染色程度降低且变得模糊和松散，β-Conglycinin及其酶解肽可显著降低上皮细胞紧密连接蛋白及其mRNA的相对表达量，影响紧密连接蛋白在细胞膜表面的分布情况，尤其是酶解肽对细胞紧密连接的破坏最严重(P<0.001)。采用竞争ELISA法，检测大豆抗原β-Conglycinin及其抗酶解肽通过上皮细胞的数量，发现有免疫活性的β-Conglycinin可以跨过仔猪小肠上皮细胞，且有时间和浓度的依赖性，酶解总产物更易跨过上皮细胞。综上，β-Conglycinin及其酶解肽对仔猪小肠上皮细胞机械屏障功能有不同程度的破坏，其中分子量较低的25+30ku混合酶解肽最为严重，52ku酶解肽次之；与β-Conglycinin相比，其酶解总产物更易跨过仔猪小肠上皮细胞。