基于非培养方法的土壤有机磷农药降解菌群解析及降解机制研究

Organophosphorous pesticides are widely used in modern agriculture and have caused serious soil contamination, threatening the ecological system and human health. Microbial degradation is an effective approach for the bioremediation of organophosphorous pesticide contaminated soils, and most of the current studies are dependent on pure cultivation approach to identify culturable microorganisms responsible for organophosphorous pesticide degradation. However, uncultivable microorganisms account for over 99% of all species on the planet, but their functions are yet not well characterized. This project focuses on i) identification of functional microorganisms in soils which could degrade organophosphorous pesticides by two cultivation-indpendent approaches (DNA-Stable Isotope Probing-DNA-SIP and Magnetic NanoParticle-MNP); ii) identification of functional genes responsible for organophosphorous pesticide degradation via constructing clone library; iii) investigation on the influence of organophosphorous pesticides on soil microbial community composition and diversity; iv) evaluating microbial degradation mechanisms of organophosphorous pesticides. This project is an interdisciplinary research of environmental microbiology, ecology, material science and analytical chemistry, aiming at providing theoretical foundation for microbial degradation of organophosphorous pesticide contaminated soils.

土壤有机磷农药污染所引起的生态风险和环境安全问题受到高度关注。微生物降解是解决土壤有机磷农药污染颇为有效的途径。目前关于有机磷农药降解菌群的研究仍停留在纯培养阶段，然而环境中超过99%的环境功能微生物为不可培养微生物。本项目拟采用基于非培养方法的DNA-稳定同位素探针（DNA-SIP）和磁性纳米材料（MNP）技术，解析有机磷农药污染土壤的降解功能微生物菌群信息；通过构建宏基因组文库，挖掘降解有机磷农药的功能基因；利用高通量测序技术，研究有机磷农药污染对土壤微生物群落结构的影响；解析有机磷农药的降解产物，分析其微生物降解机制。项目克服了绝大数微生物难以分离培养的难题，从“功能基因-功能微生物-群落结构”三个层次，揭示土壤有机磷农药污染土壤的微生物降解机制，实现了微生物学、生态学、纳米材料学、分析化学等多学科的交叉融合，为土壤有机磷农药污染的微生物降解机制和微生物修复研究提供理论支撑。

微生物降解是解决土壤有机磷农药污染颇为有效的途径，然而环境中超过99%的环境功能微生物为不可培养微生物。通过实验室纯培养的技术手段，分离出6株能够降解不同类型有机磷农药的土壤微生物，包括甲胺磷降解菌株 Brevundimonas sp. MA-B12和Alcaligenes sp. MA-B13，敌百虫降解菌株Citrobacter sp. TF-B21和Ochrobactrum sp. TF-B23，敌敌畏降解菌株Ochrobactrum sp. DV-B31，乐果降解菌株Bacillus cereus DT-B41，六种菌株对有机磷农药的降解率为58.08%- 96.42%。四种新的有机磷农药降解基因（ophB，opdE，opd，opdA）在6种降解微生物中被发现。微生物传感细胞ADP1_recA被用于评价有机磷农药及其降解产物的生态毒性效应，结果表明敌百虫和敌敌畏降解前期毒性效应降低，后期降解产物毒性反而增强。.采用基于非培养方法的磁性纳米材料（MNP）技术，解析有机磷农药污染土壤的降解功能微生物菌群信息。利用高通量测序技术，表明磁性纳米材料MNP的加入未对土壤微生物群落结构产生影响；在施加了有机磷农药乐果的土壤中，Sphingomonas和Exiguobacterium的丰度随着农药乐果的胁迫增加，说明两者对农药乐果均有耐受能力。MNP方法在降解功能微生物识别方面具有较高的灵敏度。乐果在不同的降解阶段，功能微生物的种类有所不同。在MNP分离的降解菌群中获得了新的乐果降解功能基因opdE和mpd；结合GC-MS分析，识别出乐果的三种降解产物，包括O,O,S-三甲基硫代磷酸、O,O,S-三甲基硫代磷酸盐和O,O,O-三甲基磷脂。采用基于非培养手段的DNA-SIP技术，识别乐果降解菌群。乐果降解第7 d，降解功能微生物包括Ramlibacter，Methylotenera等；乐果降解第21 d，降解功能微生物包括Ramlibacter，Methylotenera，Bacillus等；乐果降解第35 d，降解功能微生物包括Ramlibacter，Methylotenera，Bacillus等。MNP方法和SIP方法分离得到的有机磷农药降解菌株并不完全一致，可能是由于两种方法对功能微生物的敏感度不同造成的。因此建议两种方法结合，有利于更好的发掘土壤功能微生物。