植物蛋白泛素化动态修饰的定量分析

泛素化修饰介导的蛋白降解机制是真核生物中普遍存在的调控机制。本项目是关于植物泛素化修饰动态的蛋白质组水平的研究。根据国内外在这一领域的研究进展，尤其是植物领域泛素化蛋白纯化效率不够高，缺乏定量分析的现状，确定了研究内容。研究工作旨在建立高效的泛素化蛋白纯化系统，规模化的鉴定拟南芥中的泛素化蛋白底物在特定条件下的变化。采用两种方法：一种是表达Biotin-UBQ的转基因拟南芥，用avidin-resin亲和层析进行纯化；另一种是表达串联的泛素结合结构域的蛋白，对泛素化底物进行纯化。在此基础上建立定量的分析植物在响应逆境胁迫时泛素化水平发生变化的蛋白分析系统。同时结合稳定性同位素标记的方法进行定量分析：一种是用稳定性同位素标记的氨基酸对植物进行标记，另一种是用15N进行标记。通过研究初步探索泛素化修饰和其它翻译后修饰之间的关系，建立全面了解高等植物的泛素介导的蛋白降解的分析系统。

泛素化修饰介导的蛋白降解机制是真核生物中普遍存在的调控机制。本项目是关于植物泛素化修饰动态的蛋白质组水平的研究。研究工作旨在建立高效的泛素化蛋白纯化系统，规模化的鉴定拟南芥中的泛素化蛋白底物在特定条件下的变化。本项目按照研究计划进行，基本完成了研究任务。其中，泛素化修饰蛋白/肽段的富集方式由于项目启动后出现了新的方法，出现了商业化的K-ε-GG抗体，因此我们调整了泛素化修饰肽段的富集方式，以K-ε-GG抗体纯化方式为主。建立了大规模鉴定拟南芥泛素化修饰位点和泛素化修饰底物的平台。共鉴订得到4113个泛素化修饰的位点和1854个泛素化修饰的蛋白。我们发现，泛素化修饰的蛋白几乎参与了细胞内所有的生物学过程，包括新陈代谢、信号转导、DNA复制和修复、转录、翻译以及蛋白降解。组成蛋白复合体的亚基往往也是泛素化修饰的底物。包括核糖体的亚基、26S蛋白酶体、液泡ATP合酶的亚基中有一半或三分之一以上可以被泛素化修饰。这一结果暗示了泛素化修饰可能与蛋白复合体亚基间的比例调节有关，也可能与蛋白复合体的组装有关。我们鉴定得到了细胞内所有多聚泛素链的组装方式并发现有分支泛素链的存在。我们还发现参与细胞内一级代谢过程的酶类多受到泛素化修饰的调节。碳代谢途径、氨基酸合成途径中的酶类显著性的富集了泛素化修饰的底物。发现在植物体内存在一定比例的发生在丝/苏氨酸位点的泛素化修饰。在定量分析系统中，尝试了SILAC和15N的标记方法，经过摸索和实验，采用了15N的标记方式，定量分析了盐胁迫情况下泛素化修饰的变化，发现有87个蛋白在盐胁迫情况下泛素化修饰水平上升，其中一半是核糖体蛋白。定量分析了E3突变体中DOA10a泛素化修饰水平的变化，寻找到了18个潜在的DOA10a底物。鉴定了40个同时被泛素化和磷酸化修饰的蛋白。我们的工作为进一步深入研究打下了基础。