微流控芯片介孔薄膜在线多肽萃取的研究

本项目以在线、快速、高选择性内源性多肽萃取为研究目的，针对目前介孔材料多肽萃取速度较慢和目标多肽纯度不高两个基本问题，提炼出介孔材料区域选择性表面修饰和快速多肽传质两个关键科学问题，开展微流控芯片介孔薄膜在线多肽萃取研究：（1）芯片表面固载介孔材料纳米薄膜，优化介孔深宽比和薄膜厚度，减小多肽在介孔内部的传质阻力，同时，设计芯片微结构，加强湍流，加快多肽在介孔外部的传质速度，缩短多肽萃取时间；(2)生物相容性修饰介孔材料外表面，功能化修饰介孔内表面，抑制非特异性吸附，提高萃取选择性，增加目标多肽纯度；(3)多肽萃取芯片在线偶联色谱-质谱，最终实现在线、快速、高选择内源性多肽萃取、洗脱、分离和鉴定，以提高疾病相关内源性多肽标志物的鉴定水平，其中表面化学与分子传质研究也为其它纳米材料在生化分析中的应用提供重要的科学借鉴。

本项目从多肽萃取方法的定量评价、介孔纳米材料多肽萃取方法优化、表面生物相容性修饰、多肽在线萃取分析平台构建四个方面，推动多肽萃取方法发展。.1、发展多肽萃取方法的定量评价体系。批量制备34种标准多肽，建立UPLC-MS/MS（三重四极杆）多肽分析定量方法。定量评价6种常见多肽萃取方法，包括乙腈沉淀、超滤、C18萃取柱、MCM-41介孔材料分散萃取、SBA-15介孔材料分散萃取、介孔碳材料分散萃取。发现：每种多肽萃取方法都具有显著的萃取歧视效应，不能有效覆盖目标多肽，必须发展多肽萃取新材料和新方法。.2、优化MCM-41介孔材料分散萃取方法，对酶解多肽和血浆加标多肽获得理想萃取效果。其中，对20倍稀释的BSA酶解多肽，经萃取富集后，MALDI检测BSA序列覆盖度达46%，接近未稀释原液检测的48%覆盖度；对BSA酶解多肽加标血浆样品，MALDI检测BSA序列覆盖度达39%。.3、发展两种介孔材料表面生物相容性修饰方法，包括表面自组装亲水性聚合物修饰方法，以及共沉淀内外表面差异化修饰方法。聚酰胺类亲水性聚合物自组装修饰MCM-41材料，可减少95%以上的溶菌酶和牛血清白蛋白吸附。利用共沉淀法，在介孔硅材料的内表面可分别共价修饰甲基、乙烯基、正辛烷基、十八烷基、苯基等疏水功能团，外表面共价修饰亲水的烷基二醇基，显著减少蛋白的非特异性吸附，并提高血浆中内源性多肽的检出率。.4、建立两种多肽在线萃取平台，包括微流控芯片介孔薄膜在线多肽萃取平台，以及介孔材料在线多肽固相微萃取平台。在在线微流控平台中：发展了两种简单易行的制备硅橡胶微流控芯片模板技术：电路板微流通道模板和电化学腐蚀微流通道模板；在玻璃基片上，旋涂制备介孔薄膜，硅橡胶微流控芯片压封，形成封闭微流控通道，通道端口外连石英毛细管，连通液体流路，可实现多肽样品的上样、萃取、清洗和洗脱进样。但微流控平台耐压低、易泄露、萃取量小，难以实际应用。在固相微萃取平台中：制备介孔材料固相微萃取小柱，系统优化萃取、洗脱条件，实现了多肽样品的在线萃取、富集、洗脱、进样分离分析。绝大部分目标多肽可被富集150倍以上。固相萃取小柱制备简易、价格低、萃取量大，易于实际推广应用。.项目及相关研究共发表SCI文章9篇，申请发明专利7项。