骨髓间充质干细胞来源和成纤维细胞来源的iPS细胞向功能性成熟红细胞分化潜能差异及其机理研究

Induced pluripotent stem (iPS) cells are a great breakthrough in bioscience and it provides an unprecedented platform to generate functional red blood cells which is a useful treatment in clinical application. Based on the previous work of the efficient generation of iPS cells and the efficient commitment iPS cells to functional CD34+ progenitors, we found that human bone marrow mesenchymal stem cell-derived iPS cells (MSC-iPS) are more efficient than human fibroblast (Fib)-derived ones in producing CD34+ progenitors.However, the mechanism is unclear. The goal of the present study is to assess the induction capacity difference of MSC- and Fib-derived iPS cells into functionally mature RBC and its mechanism. The former is determined by analysis of several indicators as the expression of cell markers, the efficiency of red blood cells, the expression of types of hemoglobins and their efficiency during the induction. At the same time, the mechanism is studied with the focus in some hematopoietic factors as SCF and GATA-1 for their promoter methylation, the gene expression, the protein expression and the expression percentage. The study provides proofs whether the epigenetic memory of their cell-derivation lineages of induced pluripotent stem cells will be preferential for iPS cell lineage-specific differentiation and also provides an ideal cell model for generation efficient erythrocyte induction system, and the relevent disease study.

将诱导性多能干细胞（iPS）分化为功能性红细胞是目前国际研究热点。在前期工作中，我们建立了高效诱导体细胞重编程为iPS细胞及诱导iPS细胞分化为造血干细胞的技术平台。我们发现骨髓间充质干细胞（MSC）来源较成纤维细胞（Fib）来源的iPS细胞分化为造血细胞效率更高，具体机理还不清楚。本课题拟研究MSC来源和Fib来源的iPS细胞分化为功能性成熟红细胞的潜能、潜能差异及相关机理。通过检测整个诱导过程中细胞表面标记、目的细胞获得率、各种珠蛋白的表达及比例、携氧能力和Bohr效应等明确两种细胞来源的iPS细胞分化潜能及潜能差异；同时研究造血相关基因如SCF、GATA-1等启动子甲基化情况、基因表达、蛋白表达及表达量等明确差异机理。本研究为探索iPS细胞分化效率是否受到它们起源的细胞类型的表观遗传记忆影响提供依据，为建立高效红系诱导体系提供合适的细胞来源，也为红系疾病机理研究等提供理想的细胞模型。

将诱导性多能干细胞（iPS）分化为功能性造血细胞包括红细胞是目前国际研究热点。多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导性多能干细胞，具有向各个胚层发育的全能性，因而为获得功能性红细胞等造血细胞提供了无限的细胞来源。我们建立了一种高效的体细胞重编程成人iPS细胞的体系。我们利用含有四种转录因子Oct4，Sox2,c-Myc和Klf4的逆转录病毒重编程hMSCs和人成纤维细胞的技术体系，并对获得的克隆进行了细胞生物学特征的研究。另外，为了提高细胞重编程的效率，我们联合了HDA 抑制剂VPA，P53-p21信号通路抑制剂p53 siRNA和促进相关胚胎干细胞基因表达，抑制细胞凋亡Vc，高效诱导hMSCs重编程为iPSCs，效率提高可达10倍。同时，我们也建立了人iPS细胞定向分化成造血干祖细胞的新的技术方法。该方法联合多种诱导和生长因子，如BMP4，SCF, Flt3L, VEGF，以获得高效的多能干细胞分化为造血干细胞以及红细胞的效率。另外，我们利用三维诱导体系联合或者不联合多种基质细胞和/或相关诱导维持因子模拟体内造血微环境，将多能干细胞诱导分化为红细胞等多种造血细胞。在整个体系诱导过程中，我们动态检测了细胞形态学的变化，造血细胞的表面标记，转录因子的动态变化等。研究结果表明，利用多种因子的有效组合联合Yamanaka的转录因子可以有效获得细胞重编程的效率。获得的多能干细胞在我们建立的体系中能有效向红细胞等造血细胞进行分化。不同来源的多能干细胞分化为红细胞等造血细胞的效率存在差异，而不同来源的多能干细胞分化为红细胞等造血细胞在造血细胞形态、功能等方面未见差异。本研究为探索不同来源的多能干细胞包括向红细胞等造血细胞分化的差异极其机理提供了技术平台和实验依据，为建立多能干细胞向红系等造血细胞等诱导体系提供合适的细胞来源，也为红系疾病机理研究以及其它血液学疾病的研究等提供理想的细胞模型。