光子晶体色谱柱的制备及其与加压毛细管电色谱-质谱平台联用在蛋白药物肽谱分析方面的应用研究

As the rapid development of proteomics and biopharmaceutics, the quest for more powerful separation technology on protein and peptides becomes more urgent. For example, the peak capacity and resolution on the tens of thousands of proteins separation has become the bottleneck of proteomics, and peptide mapping, which is a crucial tool for the analysis of protein therapeutics, needs an analytical platform that has high separation efficiency and fast speed. Capillary column packed with silica colloidal crystals (SCC) exhibits great efficiency in liquid chromatography because of its highly-ordered structure and extremely narrow channels between the particles. However, problems arise due to the extremely high back-pressure created with its dense packings, especially with hydraulic driven force. This study aimed to synthesize sub-micron SiO2 particles and pack the particles in a capillary column with a method of SCC self-assembling with patented, electrokinetic packing technique to obtain a SCC column. The SCC column will be coupled with pressurized capillary electrochromatography-mass spectrometry (pCEC-MS) platform, which utilizes both hydraulic pressure and EOF to drive the mobile phase, to reduce the high back-pressure and provide an analytical platform with high resolution, high efficiency and fast speed in peptide mapping.

蛋白质组学和生物药物的迅猛发展，对蛋白质和多肽的分离分析技术提出了更高的要求。例如，蛋白质组学和蛋白药物分析中的关键技术之一，肽谱分析（peptide mapping）对色谱分离的柱效、分辩度、峰容量和速度都提出了巨大的挑战。光子晶体毛细管柱由于其亚微米的均一尺寸和晶格样的规则排列，在提高色谱分离的柱效、分辩度、峰容量和速度方面展现出巨大潜力。然而，在压力流驱动的液相色谱中，亚微米的光子晶体材料由于粒径极小会产生超高反压，限制了它的应用。本研究拟制备粒径均一、尺寸可控、单分散性良好的亚微米光子晶体材料，并采用光子晶体自组装与毛细管电动填充专利技术相结合，将光子晶体微球制备成光子晶体毛细管色谱柱并将其与加压毛细管电色谱-质谱平台联用，利用电渗流有效解决高反压问题的同时构建高分辨率、高峰容量、高效和快速的多肽分析平台，为蛋白质组学和生物医药的研发提供新的思路和方法。

蛋白质组学和蛋白药物分析中的关键技术之一，肽谱分析（peptide mapping）对色谱分离的柱效、分辩度、峰容量和速度都提出了巨大的挑战。光子晶体毛细管柱由于其亚微米的均一尺寸和晶格样的规则排列，在提高色谱分离的柱效、分辩度、峰容量和速度方面展现出巨大潜力。然而，光子晶体色谱柱在分离领域的应用仍存在诸多挑战亟待解决。.本研究针对光子晶体毛细管色谱柱开展了系统的研究，其中包括：（1）高质量单分散亚微米级二氧化硅颗粒的合成；（2）高碳含量色谱固定相的制备；（3）胶体光子晶体组装方法的开发和条件优化；（4）表面修饰疏水烷基基团对二氧化硅颗粒自组装生成光子晶体的机理研究；（5）光子晶体毛细管柱联用加压毛细管电色谱平台的分离性能研究；（6）光子晶体毛细管柱对小分子和蛋白质分离的应用研究。.本研究基于Stӧber法，制备了300nm-900nm的高质量单分散SiO2微球；此外开发了一种新的固定相，极大地增加了碳含量和相比例；对于光子晶体毛细管色谱柱填料，我们研究了包括重力自组装法、蒸发诱导自组装法、电场驱动填充法以及压力填充法等不同毛细管柱填充方法，结果表明：在最佳条件下，柱内的微球排列紧密有序，具有FCC结构和明亮的结构色；此外，通过表征光子晶体的光反射特性，证明了通过酸碱和酸性残余硅醇基团的相互作用，溶剂诱导的表面电荷足以诱导烷基化修饰的SiO2固定相颗粒生成光子晶体；最后，我们将光子晶体毛细管色谱柱与电色谱平台联用，研究了电渗流和双电层重叠现象，并实现了8种多环芳烃的分离，柱效超过200,000，对于多肽的分离，柱效远超UPLC；此外，考察了卵巢癌单克隆抗体与杂质的分离效果，杂质峰和单抗峰柱效分别为651,000和451,000，在pCEC模式下，蛋白质标准品的分离柱效最高，达到了每米百万级别。.本研究很好地完成了预期目标，成功制备粒径均一、尺寸可控、单分散性良好的亚微米光子晶体材料，并开发出在毛细管内部制备高质量胶体光子晶体的新方法，且该方法适用于烷基改性亚微米颗粒；最后我们通过将光子晶体色谱柱与加压毛细管电色谱联用，建出了一种高分辨率、高峰容量、高效和快速的多肽分析平台，为蛋白质组学和生物医药的研发提供了新的思路和方法。.