胆汁酸合成酶ACOX2变异重编心肌脂肪酸代谢并诱发肝硬化性心肌病的分子机制研究

More than 50% of cirrhotic patients have cardiac structure and function abnormalities, termed as cirrhotic cardiomyopathy (CMP). The major symptoms include diminished myocardial systolic and diastolic function, arrhythmia, electrophysiological abnormalities. The pathogenesis of the CMP has not been explained, there is a lack of targeted treatment. Recent studies found that excess serum bile acids cause CMP via inhibiting the myocardial fatty acid oxidation. Meanwhile, genetic variations in bile acid synthase ACOX2 lead to the accumulation of C27 bile acid intermediates and liver fibrosis in children. Our previous data indicates that ACOX2 mutation is closely related with decreased myocardial fatty acid oxidation pathway (PNAS 2017). We assumed that ACOX2 depletion might induce CMP due to dysregulated bile acid metabolism. In this study, we construct Acox2 point mutation knock-in animal model and perform primary myocardial cell culture, combined with our Acox2 knockout model and cTnI cardiomyopathy model provided by project partner, which launched integrated genomic studies on serum bile acids, cardiac systolic function and fatty acid oxidation changes in Acox2 mutant mice. This study will further clarify the mechanisms of ACOX2 variations on the induction of cirrhotic cardiomyopathy, and provide critical clues for clinical diagnosis of CPM and establish effective therapeutic strategies.

超过50%的肝硬化患者出现心脏结构与功能异常，被称为肝硬化性心肌病，主要症状包括心肌收缩与舒张功能减弱、心律失常、电生理异常等，发生机理尚未明确，也缺乏针对性的治疗手段。最新研究发现小鼠血清胆汁酸升高抑制心脏脂肪酸氧化水平而诱发肝硬化性心肌病，而胆汁酸合成酶ACOX2缺陷引起患儿肝脏纤维化和C27血清胆汁酸累积，结合申请人此前研究发现ACOX2突变与心脏脂肪酸氧化代谢酶的整体下调密切相关（PNAS 2017），推测ACOX2缺失或通过抑制脂肪酸氧化途径而引起心脏功能异常，最终导致肝硬化性心肌病。本项目拟建立人源Acox2突变敲入小鼠模型和原代心肌细胞培养体系，并结合我们现有的基因敲除模型及合作单位提供的cTnI小鼠心肌病模型，针对血清胆汁酸、心脏结构与功能及脂肪酸氧化进行整合基因组功能研究。本项目将深入阐述ACOX2突变诱发肝硬化性心肌病的分子机制，为该病的临床诊断和研发治疗提供重要线索。

脂酰辅酶A氧化酶2(ACOX2)是过氧化物酶体中胆汁酸合成和支链脂肪酸降解的关键限速酶。申请人前期发现胚系突变(p.R409H)引起的ACOX2蛋白功能丧失与心脏组织的代谢重编程密切相关[PNAS, 2017]，该突变位于一个极度保守的区域并跨越细菌和植物等多个物种，这些线索提示从进化角度来看Acox2起始的生物学功能可能与胆汁酸合成无关。在成年小鼠中Acox2基因表达主要存在于肝脏组织但在心脏中几乎检测不到表达。因此阐述Acox2参与代谢重编程的机理需要从肝脏组织开始。Acox2基因敲除小鼠出现肝脏炎症和纤维化等非酒精性脂肪肝的症状，并进一步发展成原发性肝癌。借助代谢质谱鉴定，申请人发现Nnmt及1-MNA在Acox2小鼠肝脏和血清中均显著下调。研究已知Nnmt在代谢编程和蛋白修饰中发挥重要功能，这些数据提示Acox2可能通过改变表观遗传修饰水平来介导代谢编程。进一步申请人借助蛋白互作谱发现Acox2与甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(Mccb)存在相互作用并抑制其酶活性。通过蛋白修饰泛抗体检测，Acox2敲除小鼠中非组蛋白赖氨酸巴豆酰化修饰水平显著下调。通过定量巴豆组学发现54%的携带下调巴豆酰修饰位点的蛋白位于线粒体和过氧化物酶体中进一步夯实巴豆酰基修饰在代谢调控中的重要性。结合国外同期研究，申请人发现胆汁合成酶Acox2可以通过巴豆酰化修饰介导细胞代谢稳态的调控，提示ACOX2不局限于其经典的胆汁代谢途径，为胆汁合成酶参与器官发育编程的机理提供理论补充。有趣的是，超声心动图参数提示Acox2敲除小鼠的缩短率和射血分数显著降低但左心室前壁和后壁的厚度增加，提示Acox2敲除心脏功能受损并出现肥厚型心肌病的典型症状。Masson三色染色提示Acox2敲除心脏纤维化。心肌病标志物之一的心钠肽蛋白水平在Acox2 敲除小鼠的心脏组织中被显著诱导上调，这些线索提示Acox2蛋白功能丧失导致肝-心综合征，同时Acox2是肝硬化心肌病发生的候选基因之一。进一步发现Acox2敲除小鼠心脏中的非组蛋白琥珀酰化显著下调。大约32.8%下调的Suc位点的蛋白质位于细胞线粒体。25.0%的携带30个下调Suc位点的蛋白位于与心肌病密切相关的肌原纤维蛋白中。这些结果说明去琥珀酰化是心力衰竭和心肌病的潜在共同特征，通过调控特定功能性位点的琥珀酰修饰水平在今后可以为相关疾病的治疗提供多种干预策略。