白桦CAS、DS基因RNAi及FPS基因过表达对三萜代谢流调控效应的初步研究

The program based on the system of genetic transformation of Brich (Betula platyphylla Suk.) and triterpene gene expression characteristics obtained in our labolatory. RNA interference and transgenic technology will be used to control the metabolism flow of triterpenes in the studies. On the basis of triterpenes metabolic pathway, FPS overexpression vector, CAS and DS single gene, cosuppression RNAi expression vectors will be build separately, and genetic transformation in Birch clone will be carried out. The studies will be involved the overexpression of triterpenes synthesis precursor FPS gene;suppression of separately and cosuppression of branch way CAS,DS genes to brich tissue growth, consumption of carbon source, precursor abundance,triterpenes synthesis,constituents accumulation and expression of related genes. Studies will focus on the relationship between growth and decline of triterpene constituents accumulation in transgenic birch, and the influence of precursor abundance on branch way and metabolic flow distribution mechanism. Combination of signaling molecules (MeJA and SA) induced effect, stability of DS RNAi and CAS RNAi, of FPS overexpression，and their relationship with other key enzymes will be carried out. Defense property of transgenic birch will be evaluated in order to reveal the control role of CAS, DS and FPS in triterpenes metabolic network and critical site. No reports have been published yet in this study field. Therefore, this study will provide technical support and theoretical basis for genetic improvement and biotechnology utilization of triterpenoids from Birch.

本研究是在实验室成熟的白桦遗传转化体系和掌握的三萜基因表达特性基础上提出的，拟利用RNAi（RNA干扰）及转基因技术对三萜代谢流进行调控。依据三萜代谢途径，分别构建FPS过表达载体，DS、CAS单基因及共抑制的RNAi表达载体，遗传转化白桦无性系。研究三萜合成前体FPS基因过表达，分支途径DS、CAS分别抑制和共抑制对白桦组织生长、碳源消耗、前体丰度、总三萜合成、组分积累及相关基因表达特性，重点探讨转基因白桦三萜组分积累的消长关系，前体丰度对分支途径的影响及代谢流分配机制。结合信号分子（MeJA、SA）的诱导效应检测DS和CAS RNAi、FPS过表达的稳定性及与其它关键酶之间的关系，并对转基因材料防御性能进行评价，以期初步揭示FPS、DS、CAS在白桦三萜代谢网络中的调控作用及关键结点。本研究尚未见报道，其开展将为白桦三萜类物质遗传改造和生物技术利用提供技术支持和理论依据。

白桦三萜成分白桦脂醇、白桦脂酸及其衍生物在抗HIV病毒和抑制肿瘤方面具有显著疗效。白桦各种三萜成分是以乙酰辅酶 A 原料经甲羟戊酸途径合成，均来自共同的前体物质2，3-氧化角鲨烯，这就导致几种产物之间产生竞争同一前体，并相互抑制合成，制约有效成分白桦脂醇、齐墩果酸积累及利用。本研究拟通过共代谢途径前体基因FPS的过表达及RNAi技术介导的分支途径的阻断，对三萜代谢分配进行分子调控，以促进目标产物高效积累。主要研究结果如下：.1、成功克隆白桦FPS、 BPX（CAS）、SS、SE及白桦新OSC基因BpDS，共5个全长序列，分别完成系统进化树构建及生物信息学分析；成功构建白桦三萜合成上游基因FPS、SS、SE过表达载体，完成白桦组培苗遗传转化研究及鉴定；获得FPS、SS、SE基因过表达酵母菌株，并高产角鲨烯，为进一步通过合成生物学获得白桦三萜产物奠定了基础。.2、成功构建BpDS、BPX单、双基因RNAi干扰载体，获得可遗传转化的工程农杆菌多株。完成BpDS、BPX 单、双基因干扰载体遗传转化白桦无性系，完成转基因材料分子鉴定及三萜产物分析，明确白桦中BPX2和BPDS的单基因及双基因RNAi可促使BPW和BPY基因显著上调，促进三萜前体物质向下游目标三萜产物白桦脂醇和齐墩果酸的合成和积累。其中BpDS RNAi转基因白桦株系Y1和B3中 BPY基因的表达量显著被抑制分别为照相2%和9%，Y1中白桦脂酸、齐墩果酸和白桦脂醇含量均显著高于野生型对照，前两种物质分别比对照提高1.95倍和41.3%，Y30白桦脂酸比野生型提高85%。BPX23-D的RNAi 转基因白桦苗中Y-12、B-6的BPX2基因的表达被显著抑制，表达量分别为对照的3%和48%，转基因植株中，BPY和BPW表达量显著高于对照，其中B6、Y12齐墩果酸含量比野生型高 7.86 倍和4.93倍，白桦脂酸含量也得到显著提高。研究结果明确BpDS、BPX单、双基因RNAi干扰可显著促进三萜前体向下游目标产物白桦脂酸、齐墩果酸合成与积累，该研究结果为通过基因工程手段进行白桦三萜途径遗传改良奠定了基础，获得的转基因白桦为白桦三萜类药物进一步应用提供了材料资源，具有重要的理论意义和社会价值。