根癌农杆菌GW4厌氧锑氧化酶鉴定和铁-氮-锑耦联机制

Antimony is a metalloid, and the contamination is very serious around mining and smelting areas. Antimonite-oxidizing bacteria oxidize the toxic antimonite [Sb(III)] to the less toxic antimonate [Sb(V)], which contribute to the environmental Sb(III) detoxification. Previously, we clarified the mechanism of aerobic Sb(III) oxidation in facultative anaerobic Sb(III)-oxidizing strain Agrobacterium tumefaciens GW4. In addition, based on our preliminary results, we found that this strain was able to oxidize Sb(III) and Fe(II) under anoxic conditions using nitrate (NO3-) as the electron acceptor，and bacterial Sb(III) oxidation rate was promoted by the addition of Fe(II) and NO3-. However, the mechanism of anaerobic Sb(III) oxidation and the coupling mechanism of Fe-N-Sb are still unknown. In this project, we will use comparative proteomics, qRT-PCR, gene knock-out and complementation, protein expression and purification, and kinetic analyses to identify the candidate anaerobic Sb(III) oxidase. Gene transcription analyses, deletion and complementation of the genes involved in denitrification, enzymatic and non-enzymatic anaerobic Sb(III) oxidation experiments will be employed to investigate the mechanism of anaerobic Sb(III) oxidation promoted by Fe(II) and NO3-. Meanwhile, energy-dispersive X-ray spectroscopy and X ray diffraction will be used to determine the chemical composition of precipitate produced in the process of cultivation. The results of this project will clarify the mechanism of bacterial anaerobic Sb(III) oxidation and reveal the coupling mechanism of Fe-N-Sb driven by Sb(III)-oxidizing bacteria. Such project provides innovative scientific significance and potential application value in the remediation of anaerobic antimony pollution.

锑是类金属元素，在矿区周围污染严重。锑氧化细菌将毒性强的亚锑酸盐Sb(III)氧化为毒性弱的锑酸盐Sb(V)，具有环境解毒意义。前期，我们利用兼性厌氧型锑氧化根癌农杆菌GW4阐明了有氧条件下的锑氧化机制；并发现其在厌氧条件下以NO3-为电子受体氧化Sb(III)和Fe(II)，且Fe(II)和NO3-促进锑氧化，但细菌厌氧锑氧化和铁-氮-锑耦联机制尚未阐明。本课题拟利用比较蛋白质组学结合定量PCR、基因敲除和互补、蛋白表达纯化及酶反应动力学鉴定菌株GW4中潜在的厌氧锑氧化酶；通过基因转录分析、敲除和互补反硝化过程关键基因及酶促和非酶促的厌氧锑氧化实验解析Fe(II)和NO3-促进锑氧化的机理；并利用X射线能谱分析和X射线衍射等确定培养过程中产生沉淀物的化学成分。本课题结果将阐明细菌厌氧锑氧化及其在含铁环境中驱动的铁-氮-锑耦联机制，具有创新性科学意义，在厌氧锑污染环境修复中有潜在应用价值。

锑 (Sb) 污染问题在全球范围内十分严峻。微生物将亚锑酸盐 [Sb(III)]氧化为锑酸盐[Sb(V)] 是一种有助于Sb(III) 抗性的解毒过程。前期，我们在根癌农杆菌 GW4 中发现并鉴定了新型Sb(III) 氧化酶 AnoA，但其调控机制仍未知。本课题中，我们发现磷酸盐调控子PhoB 作为一个全局性调控蛋白能够正向调节 Sb(III) 氧化，并且与Sb(III) 抗性相关。这也为锑和磷的共代谢提供了新的思路。..此外，为了进一步揭示细菌的锑抗性机制，我们利用菌株GW4进行了加锑和不加锑条件下的代谢组学研究，结合前期的蛋白质组学共同分析发现：在加Sb(III)条件下，（1） 糖异生分支途径下调导致磷酸戊糖途径增强，产生更多合成代谢的前体物质，NADPH等；（2）甘油磷脂和花生四烯酸代谢下调，导致更多乙酰辅酶A进入TCA循环产生更多能量用于大分子物质合成；（3）核苷酸和脂肪酸合成途径增加，保护细胞免受 DNA和脂质过氧化的影响；（4）烟酸新陈代谢增加，辅酶合成增加参与更多催化反应；（5）GSH合成增加，防止过氧化，并且可能参与Sb(III)的外排。本课题进一步加深了我们对锑抗性机制以及相关代谢通路的认识。..与微生物有氧 Sb(III)氧化相比，厌氧 Sb(III) 氧化的机制以及硝酸盐和Fe(II) 对Sb转化的影响仍然未知。本课题中，我们利用兼性厌氧 Sb(III) 氧化菌 Sinorhizobium sp. 作为研究对象研究厌氧Sb(III)氧化与Fe(II)氧化和反硝化相关性及偶联的机理。我们发现：（1）在厌氧条件下硝酸盐作为电子受体时，GW3菌株在培养过程中能够同时氧化Fe(II)和Sb(III)；（2）EDS、XPS和XRD分析表明在Fe(II)和Sb(III)氧化过程中产生了含Fe(III)矿物，这是一种有效的非生物化学氧化剂催化Sb(III)氧化，生成的 Sb(V) 吸附或共沉淀在Fe(III)矿物上。该过程包括生物和非生物因素，共同在厌氧条件下有效地固定和去除可溶性 Sb(III)。该研究结果对理解锑的生物地球化学循环具有重要意义，为锑污染的修复提供新的思路，具有环保价值。