黄芩苷通过调控细胞自噬和TLR2信号通路干预鸡毒支原体感染炎症反应的机制研究

Recognition of Toll receptors (TLRs) and autophagy of immune cells are two different ways for hosts to defense the invading pathogens, and play crucial roles in innate immune response. We have previously proved that lipid-associated membrane protein (LAMPs) of Mycoplasma gallisepticum（MG）induced IL-1β expression, and infection of mouse macrophage cell line RAW264.7 with MG activated autophagy. In order to explore the effect and mechanism of baicalin on MG infection, in the present project, we will confirm the role of TLR2 in the inflammation induction of live MG by alveolar macrophages HD11, TLR2 shRNA and overexpression. The change trend of autophagy with MG infection time or concentration will be determined by assay methods e.g. confocal fluorescence microscope, western blotting, Real-time PCR, then the interaction between autophagy and TLR2 and the pathway mechanisms were investigated by applying TLR2 shRNA cells, chemical inhibitors or inducers of autophagy and inhibitors of MAPK or NF-κB signal pathway. Based on the above researches, the intervening effect of baicalin on MG infection and the regulatory mechanism via autophagy and TLR2 pathway will be explored so as to provide powerful theoretical basis for the scientific evaluation on its pharmacologic action.

免疫细胞Toll受体（TLRs）识别和自噬在机体防御病原体入侵，诱导先天性免疫反应中起关键作用。课题组前期研究已证明鸡毒支原体（MG）脂质相关膜蛋白（LAMPs）可通过TLR2诱导鸡成纤维细胞DF-1释放IL-1β；MG感染RAW264.7小鼠腹腔巨噬细胞可诱导自噬产生。为探索黄芩苷的抗MG感染机制，本项目首先采用TLR2 shRNA、过表达技术明确TLR2对活的MG诱发鸡肺泡巨噬细胞HD11炎症反应的作用；通过激光扫描共聚焦、western blotting、Real-time PCR技术确定MG感染对HD11细胞自噬的诱导作用；应用TLR2 shRNA、自噬抑制剂/诱导物及通路抑制剂，确定TLR2介导自噬的MAPK或NF-κB信号机制；在以上研究基础上，采用体内、体外试验证明黄芩苷对MG感染的干预作用，并探索其对自噬和TLR2信号通路的调控机制，为科学评价其药理作用提供有力的理论依据。

鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum, MG）引起的鸡慢性呼吸道病被公认为最难缠、最棘手的疾病，尤其是其易继发细菌、病毒的混合感染常常给养禽业带来巨大损失，因此对MG的防控尤为重要。临床常使用大环内酯类和四环素类等药物进行治疗，但这些药物往往只能缓解临床症状，不易根除支原体。由此造成了内源性持续感染，尤其是集约化养殖场一旦感染则难以清除该病。近年来宿主抗炎性损伤的分子免疫机制越来越引起研究者的关注，以期望找到防治该病的新方法。为解决这一问题，本项目在研究巨噬细胞自噬和TLR2介导MG炎症反应的基础上，探索黄芩苷的抗MG感染作用及其对TLR2和自噬的调控机制。首先以RAW264.7为研究对象，用MG感染RAW264.7细胞，联合应用TLR2 siRNA、MEK抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125及p38抑制剂SB203580，通过Western blot、LC3免疫荧光染色、透射电镜等技术检测细胞自噬的发生及其所激活的信号通路，结果证明了MG诱导的RAW264.7细胞自噬是通过TLR2介导的ERK1/2信号通路，为进一步研究MG致病机理奠定了基础。之后采用浓度为5×10^9 CCU/mL的MG 菌液0.2 mL以气囊接种的方式感染7日龄雏鸡构建MG感染模型，于感染后第3 d开始将黄芩苷混于水中饲喂治疗，结果证明了黄芩苷能够通过抑制MG感染时炎性因子IL-1β、TNF-α的释放，干预MG感染造成的炎症损伤。同时，黄芩苷也能够通过抑制p65蛋白的磷酸化，干预TLR2-NFκB信号通路的活化，进而影响炎性因子的表达；病理学检查结果可见黄芩苷可有效改善MG感染所引起的组织和细胞炎症损伤。进一步实验证明了黄芩苷治疗能有效预防MG诱导的鸡肺部组织的炎症、细胞凋亡和能量代谢功能障碍，并可通过恢复脾脏线粒体动态变化缓解MG感染所致的氧化应激及凋亡，同时从炎症、凋亡和自噬的交叉与融合入手，证明了黄芩苷能够有效干预 MG 所致的鸡法氏囊免疫损伤，以上发现为 MG 感染的发生机制提供参考并为黄芩苷的靶向治疗研究提供了新思路。