载Axitinib的仿生纤维支架对皮下再生软骨表型的稳定作用与机制研究

Tissue engineered chondrocytes are known to be unstable in phenotype under the subcutaneous environment. In the current study, based on a strategy that mimics the native extracellular matrix, we propose an electrsopun gelatin-PCL (Gt-PCL) nanofibrous scaffold loaded with Axitinib (a novel anti-vascularization drug) to construct a microenvironment to inhibit vascularization, finally stabilizing the phenotype of regenerated chondrocytes. To this end, we will first prepare an Axitinib-loaded nanofibrous scaffold that has controlled release of drug via electrospinning. Then the anti-vascularization capability and side effect of the scaffold will be determined by cell study. At last, we will discuss the mechanism how the drug-loaded scaffold functions in the stabilization of regenerated chondrocytes with bone mesenchymal stem cells under subcutaneous condition using large animals. The proposal is expected to solve the problem that stem cells are feasibly committed osteogenic differentiation and also promote the clinical translation of tissue engineered chondrocytes, as well as provide a proof-of-principle for the regeneration of some other avascular tissues such as cornea and tendon.

本项目针对组织工程化软骨在皮下植入环境中的表型不稳定问题，基于可抑制血管化的仿生细胞外基质构建策略，提出将一种新型的抗血管化小分子药物Axitinib引入到电纺明胶-聚己内酯（Gt-PCL）纳米纤维中，构建一个可抑制血管化的微环境，从而稳定软骨表型的研究设想。为此，项目将首先通过静电纺丝技术，制备出含量及释放速率稳定可控的载Axitinib的Gt-PCL纳米纤维材料，接着在细胞水平探讨材料的抗血管活性及毒副作用，最后探讨该载药纤维支架对骨髓基质干细胞（BMSCs）在大动物皮下环境中再生软骨的表型稳定作用与机制。本项目的顺利完成有望解决干细胞在皮下环境中容易骨化这一难题，推动组织工程软骨的临床应用转化，并为其它无血管组织如角膜、肌腱的再生提供参考。

本基金研究用共混纺丝技术制备了含量为0%，1%，3%，6%的载Axitinib 的四种不同Collagen/PCL纳米纤维。用扫描电镜观测发现Axitinib的载入并未影响材料的可纺性，并且所有材料均有60%以上的拉伸性能，可以满足体内植入需要。Axitinib载入材料后可以稳定缓释2月以上后仍有30%-40%的药物剩余，可以体内较长时间抵抗血管的侵入。此外载入Axitinib的材料可以对接种在材料上的HUVECs产生明显的剂量相关的生长抑制，但却并未对接种在材料上的BMSCs和软骨细胞产生明显影响。将兔BMSCs体外成软骨诱导4周后，获得的BEC用制备的不同含量的Axitinib纳米纤维膜片封装包裹后植入裸小鼠皮下，对照组未用任何纤维膜片包裹，分别在体内植入4周，12周，24周后取样进行大体观察，病理切片，micro CT骨化评估，蛋白及转录组学鉴定等。我们发现没有任何保护的对照组在植入体内4周后即发生明显骨化，大部分区域软骨表型丢失，代之为骨样结构，0%Axitinib组在早期仍可保持组织结构完整，大部软骨表型保留，24周后跟对照组相似基本完全转化为骨组织；1%Axitinib组虽然始终保持了组织结构的完整，但是在12周时已不能抵抗血管的爬入，软骨肥大明显，细胞数量明显减少，基质钙化明显。3%以上Axitinib封装组，则在皮下植入24周后仍能维持软骨表型的稳定，组织钙化区域较少。进一步转录组学及蛋白定量等表明，如果在体内能够成功较长时间抵抗血管化侵入，BEC有一定的“自我成熟”倾向，即借助抗血管化的支架材料，有望使得短时间体外成软骨诱导的BEC也可在皮下环境长时间维持软骨表型稳定，而不发生明显骨化，推动组织工程软骨的临床应用转化，并为其他无血管组织如角膜的再生提供参考。