间充质干细胞移植通过COX-2通路调控巨噬细胞活化治疗巨结肠相关性小肠结肠炎

Hirschsprung disease allied enterocolitis (HAEC) is one of the commonst complications of Hirschsprung disease, and lack of the most effective treatment. Our previous research have showed that the activation of macrophage played important role in the process of HAEC, and MSCs transplantation surpressed the activation of macrophage in HAEC model mice. On the basis of the previous results, human deciduous teeth dental pulp mesenchymal stem cells (MSCs) would be innovatively injected into the HAEC model mice intraperitoneally, the aim of this study is through the observation of changes of symptons and inflammation response in both experiment group and control group after MSCs transplantation, and the detection of the expression changes of macrophage proteins and inflammation response of intestinal epithelium cells (IEC) in vitro, to highlight MSCs could play a role of immune regulation after transplantation in HAEC model mice through multi-paths, clarify the key passways of up- and downstream of macrophage activation by COX-2 through the RNA sequency analysis and cytokines antibody microarray technologies, pinpoint the passway of inflammation and apoptasis processes of IEC. Through this study, the theory of MSCs improving the inflammation response of HAEC by macrophage activation through the COX-2 pathway will be clarified.

巨结肠相关性小肠结肠炎（HAEC）是先天性巨结肠最常见的并发症，一直缺乏对于其的最有效治疗。前期实验已证实巨噬细胞的活化在HAEC中发挥了重要作用，并预实验证实间充质干细胞（MSCs）移植后可抑制HAEC模型鼠中肠道巨噬细胞的活化。本课题拟在前期研究的基础上，创新性地采用人类乳牙牙髓来源MSCs经腹壁移植入HAEC模型鼠体内，通过观察实验组及对照组的大体症状改变和体内各炎症因子及免疫细胞的表达变化，明确MSCs可通过多途径发挥其在HAEC中的抗炎作用；同时进一步检测COX-2通路被抑制前后小鼠肠道巨噬细胞的活化功能改变，证明COX-2参与了肠道巨噬细胞的活化，并利用RNA水平分析和细胞因子抗体芯片技术证明COX-2活化巨噬细胞的上下游关键信号因子；以及通过离体实验检测肠上皮细胞的通透性及凋亡改变，明确其炎症及凋亡通路。阐明MSCs通过COX-2活化巨噬细胞，改善HAEC炎症反应的机理。

先天性巨结肠相关性小肠结肠炎（Hirschsprung disease associated enterocolitis, HAEC）是先天性巨结肠的常见并发症，临床表现包括呕吐、腹泻、腹胀，发热及脱水等一系列肠道及全身性症状，发病率高达20%-50%。对患儿控制排便能力和长期生活方式上存在诸多影响。目前HAEC的病因仍不完全清楚，其高发诱因包括肠神经系统（Enteric nervous system, ENS）缺如导致的肠动力障碍和体内异常的炎症反应等。.由于其免疫调节功能突出，牙髓干细胞（Dental Pulp Stem Cells，DPSCs）被视为将来组织工程及再生医学的最佳干细胞来源之一。我们首次探索应用DPSCs对HAEC小鼠模型进行治疗，观察其治疗效果，为临床治疗HAEC提供新思路。.DPSCs移植后Ednrb-/-小鼠生存率明显长于对照组，肠道粘膜损伤程度减缓，炎症细胞浸润减少，未见明显的隐窝炎及隐窝脓肿。模型组小鼠扩张段结肠比正常组小鼠结肠CD4、CD20、CD56以及CD68的表达水平明显升高，而DPSCs移植组扩张段结肠较模型组扩张段结肠CD4、CD20、CD56以及CD68的表达明显降低。此外，COX-2抑制DPSCs发挥免疫调控功能口服COX-2抑制剂塞来昔布后，DPSCs注射后，没有见到明显的减轻，与肠炎小鼠肠道相比，仍然有大量的炎性细胞浸润。巨噬细胞用lps激活成M1型炎症的巨噬细胞，然后将DPSCs与巨噬细胞共培养，可见在共培养1，6，12h后，炎症因子TNF-α，IL-6，TGF-β的mRNA表达水平明显受到抑制，而IL-10水平有所升高，Westernblot结果与此类似。我们再通过检测MAPK信号通路上的关键基因，发现DPSCs与巨噬细胞共培养后，能抑制P-ERK及P-P38的磷酸化表达水平，证明DPSCS通过抑制MAPK信号通路来达到抑制巨噬细胞活化的效果。.在本课题中，我们以EDNRB基因敲除鼠作为HAEC模型，试图用牙髓干细胞治疗HAEC。在体内和体外实验均得到了较满意的结果。我们发现牙髓干细胞可有效地在体内外发挥免疫调控的功能，能抑制炎症过程中巨噬细胞的活化，进一步减缓炎症对组织细胞带来的损伤，有效延长HAEC小鼠的寿命。我们将继续对该治疗方法进行深入的研究，希望早日运用在临床实践中。