斜卧青霉基因表达谱差异分析及其在生物质降解酶合成分泌中的应用研究

利用数字化全基因组表达谱分析方法，获得斜卧青霉在纤维素诱导和葡萄糖阻遏条件下全基因组范围的基因表达谱信息，实现对基因表达的定量测量；结合样本性质差异，特别定位于探索其胞外生物质降解酶系的合成分泌相关的新的关键差异基因。建立完善的斜卧青霉遗传操作系统平台，通过基因敲除、过表达、基因沉默等方法研究差异表达基因在实验样本中的行为和功能。研究不仅可以从理论上丰富对丝状真菌生物质降解酶合成和分泌机理的认识，并且对提高丝状真菌生物质降解酶的生产具有重要意义。

通过新一代Solexa测序技术的数字表达谱分析方法，构建了斜卧青霉在纤维素诱导与葡萄糖阻遏培养条件下的两个表达谱数据库。将有显著差异的表达标签与斜卧青霉基因组数据进行比对注释。结果显示，诱导条件下表达显著上调的基因包括多种木质纤维素降解酶类以及其它糖苷水解酶类基因，显示这些基因转录的共调控。对诱导 条件下表达显著下调标签的注释显示，多个金属离子运输蛋白、一些MFS转运蛋白及未知功能膜蛋白存在显著下调表达。采用RT-qPCR技术对斜卧青霉114-2在不同碳源（葡萄糖、山梨糖、乳糖、纤维二糖、纤维素和麦麸）培养条件下的4个纤维素酶基因（cel7B、cel5A、cel7A、cel6A）和2个木聚糖酶基因（xyn10A 、xyn11A）的转录情况进行了分析，结果显示以上基因在转录水平上存在共调控。乳糖对斜卧青霉中纤维素酶和半纤维素酶基因表达有很强的诱导作用，山梨糖没有表现出明显的诱导作用。在斜卧青霉基因表达谱差异分析的结果基础上，选择了部分基因开展功能研究。其中对brlA基因的研究结果显示，brlA的缺失不仅阻碍了分生孢子的生成，引起菌丝分支增加，而且在brlA缺失株中，葡萄糖淀粉酶蛋白的显著表达和多种胞外蛋白表达的上调，其中至少包含有3种主要的纤维素外切酶（CBH IA，CBH IB和CBH II）、两种主要的纤维素内切酶（EGI和EGII）、两种主要的木聚糖酶（XYN10A 、XYN11A）、两种几丁质酶。同时，对敲除株胞外酶活力的测定结果也显示了其胞外纤维素酶活力的上升。研究显示brlA基因不仅参与了斜卧青霉的孢子发生，同时参与了其生物质降解酶合成分泌的调控。. 以上研究将有助于今后利用基因工程、代谢工程等手段改良工业菌株斜卧青霉，提高其生物质降解酶合成分泌的能力。研究工作发表SCI论文三篇。.