neuroplastin 65 对脑卒中神经保护作用及其机制的研究

neuroplastin65(np65)是脑特异性的突触膜糖蛋白，参与突触可塑性。我们的实验发现np65促进小脑颗粒细胞和海马神经元突起生长、促进神经元存活。np65 是否是一新的神经保护剂？本课题拟用np65 knock down 的小鼠(np65+/- )，首先体外培养其海马和皮质神经元，观察神经突起的生长；制备培养神经元损伤模型，观察神经元的存活率；其次制备np65+/-小鼠脑卒中模型，通过动物神经功能评分和脑梗塞体积观察np65 对脑卒中的神经保护作用；用Western blotting 、TUNEL 染色、Elisa、免疫双标等方法从神经元凋亡、神经再生、神经组织重塑、神经营养因子等方面初步探讨其机制；最后电生理研究np65+/-小鼠的突触可塑性。本研究结果将阐明np65 的新功能-神经保护及机制，有助于认识脑的发育与可塑性，并可能为脑卒中等神经疾病的治疗开发一新的神经保护剂。

本项对项目的完成情况及取得成果做简单概述，目根据研究计划，完成了全部的研究内容。研究成果：1 制备了np65基因敲除（NP65-/-)小鼠，体内和体外海马神经元培养，免疫染色显示NP65(-/-) 小鼠海马神经元表达MAP-2而不表达NP65；2 NP65(-/-) 对神经突起生长的影响：海马神经元培养48 h，与野生型相比，NP65(-/-) 小鼠海马神经元神经突起的长度和最长突起长度较野生型的短；初级突起的数目比野生型的多；次级突起的数目和长度无显著差别。此外，MEK1/2 的特殊抑制剂U0126、JNK inhibitor的特殊抑制剂SB203580和p38MAPK的SP600125，显著抑制了野生型和NP65(-/-) 小鼠的神经突起的长度都（P<0.05）；3 NP65(-/-) 不影响马神经元的活性：海马神经元培养4天，Hoechst 33258 染色和CCK 试剂盒分析，均显示，NP65(-/-) 对海马神经元活性没有影响；4 NP65(-/-)增强小鼠的认知能力：水迷宫实验显示，NP65(-/-)基因敲除小鼠穿越平台的次数较野生型显著增加；逃避时间比野生型显著减少，提示NP65（-/-）小鼠学习和记忆功能较较野生型好；5.NP65(-/-) 小鼠GFAP细胞数量显著增加：尼氏染色显示神经元胞体的形态特点在NP65(-/-)和野生型小鼠之间没有差异，但是NP65(-/-)小鼠的海马神经元密度比野生型显著增加，而在皮质两组之间没有差别；GFAP 免疫染色显示NP65(-/-)小鼠海马和大脑皮质的星形胶质细胞的数量较野生型显著增加；6 NP65(-/-) 抑制长时程增强效应：制备小鼠海马脑片，神经电生理实验发现NP65(-/-) 能诱导兴奋性突触后电位，但不能维持。7 高尔基染色显示NP65(-/-)成年小鼠神经突起数目多； 8 制备脑卒中动脉模型，线拴法制备小鼠大脑中动脉阻塞模型，让动物存活1周，实验结果：（1）NP65(-/-)小鼠神经功能损伤程度比野生型轻；（2）TTC 染色显示，脑卒中1周时，NP65(-/-)小鼠脑梗塞体积比野生型小；（3）尼氏染色显示，NP65(-/-)小鼠海马和齿状回的神经元数量比野生型小鼠的多；（4）TUNEL染色显示，NP65(-/-)小鼠海马神经元凋亡的数量比野生型的少。