免疫缺陷小型猪模型（裸猪）的建立

免疫缺陷小鼠在肿瘤学研究、免疫学研究、干细胞研究、人源化器官等方面得到了广泛应用。但是，由于小鼠在很多方面与人类差别巨大，这些研究结果很难直接应用于人类疾病的研究。近年来，小型猪作为模式动物由于其在生理、体型大小等方面与人类更为接近，已经被越来越多的应用于生物医学研究。建立免疫缺陷小型猪，在肿瘤学研究、免疫学研究以及利用猪生产人源化器官的异种器官移植研究方面具有广阔的应用前景，对于完善小型猪这一模式动物，促进生物医学研究具有重要意义。在小鼠中已经证明负责淋巴细胞成熟过程的关键基因RAG1或者RAG2基因的缺失能够引起成熟B细胞和T细胞同时缺失，最终导致免疫缺陷。本研究将采用我们新近建立的锌指核酸酶基因打靶猪技术，将猪胎儿成纤维细胞的RAG1/2基因定点失活，通过体细胞核移植技术获得RAG1/2基因敲除的克隆猪，最终建立免疫缺陷的小型猪模型。

从发现第一种自然突变的免疫缺陷小鼠开始，科学家们开发出了很多类型的免疫缺陷小鼠品系，这些小鼠被广泛应用于免疫、感染、肿瘤和再生医学的研究中。但小鼠体型小，寿命短，不利于手术操作和长期跟踪，且与人类遗传背景和生理指标差异较大，这些都限制免疫缺陷小鼠在临床前研究中的应用。猪在生理、生化和解剖等方面与人类很相似，小型猪体型适中，寿命较长，并且，猪的免疫系统与人类的相似度极高，因此，被认为是研究人类免疫的更好的模型。因此，建立免疫缺陷小型猪模型，可克服以上小鼠模型的缺点，为再生医学、同种或异种移植及免疫系统重建等相关研究提供重要工具。.重组激活基因（RAG1和RAG2）是T、B淋巴细胞成熟的关键基因。在小鼠中已证实RAG1或者RAG2的功能缺失都能引起成熟 T 细胞和B细胞同时缺失，即联合重症免疫缺陷（SCID）。本研究希望通过敲除猪的RAG1/2基因，建立了重症联合免疫缺陷小型猪模型。.首先，我们用同源重组（HR）、锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应核酸酶（TALEN）技术在巴马猪胎儿成纤维（PFFs）中对RAG1进行敲除，用TALEN技术对RAG2进行敲除。其中，用ZFN技术获得了2个（0.075%）RAG1敲除细胞克隆，用TALEN技术获得了55个（30.4%）RAG1敲除和98个（21.6%）RAG2敲除细胞克隆。接着，我们挑选了其中用TALEN技术获得的6个RAG1纯合敲除克隆、5个RAG2纯合敲除克隆、1个RAG1和4个RAG2杂合敲除克隆作为核供体进行体细胞核移植来获得克隆猪。重组胚被移植入24头代孕母猪，其中13头怀孕到期并自然分娩。我们一共获得27头存活克隆猪，其中9头为RAG1纯合敲除猪，3头为RAG2纯合敲除猪，10头为RAG2杂合敲除猪。.对获得这些的RAG1/2纯合敲除猪进行分析发现：与同日龄的野生型（WT）相比，RAG1/2基因敲除猪的胸腺很小且严重发育不全，脾脏中没有明显的淋巴细胞聚集区；外周血，胸腺、骨髓和脾脏中没有成熟的T细胞、B细胞且不发生V（D）J重组。RAG1/2基因敲除猪呈现明显的重症联合免疫缺陷表型，在普通饲养环境中存活不超过一个月，而RAG2杂合敲除猪能正常发育至性成熟。.本研究通过结合TALEN技术与体细胞核移植技术，成功建立的RAG1/2基因敲除的重症联合免疫缺陷小型猪模型。这些SCID猪将有望成为生物医学和转化医学的