溶瘤性单纯疱疹病毒GD116的开发及其对人乳腺癌的治疗作用

乳腺癌是女性中发病率最高的恶性肿瘤。美国近年研发出肿瘤基因治疗的新型病毒载体G47△在美国及日本进行了II期及III期临床试验，取得了较好的疗效。但是国外相关研究及本课题申请人的最近实验均发现该病毒因其γ34.5基因被剔除而降低了复制繁殖能力，使其对部分乳腺癌细胞如MDA-MB-231及ZR-75-1等多种乳腺癌细胞无明显杀伤作用，为此，对其基因进一步改造尤为必要。.本课题拟将γ34.5类似物MyD116基因插入G47Δ病毒基因中，恢复类似γ34.5基因的功能，研发出消除了神经毒性而复制能力更强劲的新型病毒载体GD116，进一步通过体外实验及动物体内实验证实其对多种乳腺癌的治疗作用，预计其疗效将明显超过其父代G47△，将会给乳腺癌治疗带来一种更为有效的新方法。

背景：溶瘤性单纯疱疹病毒-1（oHSV-1）是一种有效的抗肿瘤载体，病毒基因组内γ34.5基因的删除确保了G47Δ溶瘤病毒载体的低神经毒性，但同时该基因的删除也减弱了病毒复制能力；有研究表明γ34.5的类似物MyD116的羧基端与前者高度同源，因此可代替前者而发挥促进病毒复制的作用。 .目的：将γ34.5-MyD116嵌合基因插入到G47Δ病毒基因组并构建新型病毒载体GD116-G47Δ，观察新型溶瘤病毒对人乳腺癌细胞的杀伤作用。 . 方法：以细菌人工染色体（BAC）系统作为基础，在菌体外，通过Cre/loxP位点特异性同源重组系统将CMV启动子及γ34.5-MyD116目的基因插入到G47Δ-BAC基因组内，通过电穿孔转化到大肠杆菌E.coli-DH10B内进行克隆；然后在Vero细胞内，再通过FLPe/FRT同源重组系统将γ34.5-MyD116-G47Δ-BAC基因组的BAC序列进行剪切，从而构建完整的GD116-G47Δ病毒载体；以同样的方法构建仅含CMV启动子不含目的基因的CMV-G47Δ载体作为对照组，检测新型病毒的复制能力以及对不同乳腺癌细胞株的毒性作用。 . 结果：通过同源重组系统成功构建了GD116-G47Δ及CMV-G47Δ两种病毒载体，在MDA-MB-231细胞中，新型溶瘤病毒GD116-G47Δ在感染后24小时及48小时的病毒复制产量明显高于对照组；当MOI=0.1及MOI=0.3时，GD116-G47Δ对乳腺癌细胞的毒性作用均强于对照组CMV-G47Δ。 . 结论及意义：MyD116的羧基端可替代γ34.5基因的羧基端，并抑制早期病毒蛋白合成的关闭，从而发挥促进溶瘤病毒在细胞内的复制；新型溶瘤病毒载体GD116-G47Δ对于乳腺癌细胞的杀伤能力强于CMV-G47Δ，从而为临床治疗乳腺癌提供新的思路。