miR-365介导机械负荷诱导的软骨细胞分化的机制研究

关节软骨细胞的分化抑制功能破坏是骨性关节炎（OA）的重要病理基础，不良的机械刺激在骨性关节炎发生和发展中扮演着重要角色。我们在前期实验中发现，机械刺激升高软骨细胞的微小核糖核酸365（miR-365）的表达水平，miR-365可以通过抑制HDAC4基因表达促进软骨细胞分化。在此基础上，本项目拟采用软骨细胞三维立体培养和连续的周期性细胞力学刺激以及miR-365模拟物和抑制物的细胞转染等综合技术，以分化性软骨细胞和关节软骨细胞为研究对象，探讨机械刺激调控软骨细胞分化的机制，分析OA疾病发展过程中软骨细胞机械转导所涉及的重要信号通路，明确软骨细胞的miR-365在机械信号向生物效应转化过程中的介导作用，为探寻OA治疗的新靶点建立理论依据。

背景：正常关节软骨细胞终身保持成熟状态，和生长板的软骨细胞不同，它们并不分化进入肥大阶段。当关节软骨细胞分化进入肥大阶段，软骨组织就表现出骨性关节炎的病理特征。而不良的机械刺激在骨性关节炎发生和发展中扮演着重要角色。力学因素导致骨性关节炎的分子机制尚未阐明。实验发现，机械刺激升高软骨细胞的微小核糖核酸365（miR-365）的表达水平，miR-365可以通过抑制 HDAC4基因表达促进软骨细胞分化。由于这一重要发现来源于分化性软骨细胞，而关节软骨的相关机制的解释还需直接的实验数据。为此，我们设计了三部分实验并进行了相关工作。主要内容：1）动物实验：取健康Wistar大鼠20只平均分为2组，每组10只。第1组采用Hulth模型，左膝切断前交叉韧带并去除内侧半月板，右膝假手术用于对照。第2组采用化学模型，左膝关节腔内注射胶原蛋白酶0.5mg（0.1ml），右膝注射生理盐水用于对照。模型建立后的3周以及6周，取关节软骨染色，检测miR-365表达水平。实验结果表明，两种模型建立6周后，关节软骨达到了相同的退变水平。在此相同的退变情况下，Hulth模型组（n=8）的Mir-365表达量明显高于关节腔注射组(n=9)，T检验，p≤0.05。2）人关节软骨Mir-365表达检测：从临床进行全膝关节置换术病人中筛选病人，分成原发性骨关节炎组和创伤性骨关节炎组，每组用非承重区软骨作对照，参照TaqMan公司提供的miRNA检测方法对软骨细胞的 miR-365表达水平进行检测。实验结果表明，无论原发性骨关节炎组还是创伤性骨关节炎组，其病变区Mir-365表达水平均显著高于相应无病变对照区水平，但两组病变区之间表达量无明显差别,T检验，p≥0.05。3）人关节软骨细胞miR-365表达干预：通过干预人软骨细胞的miR-365表达水平观察骨关节炎标志性基因的表达变化，主要包括正常软骨细胞转染Mir-365类似物（过度表达），OA软骨细胞转染Mir-365抑制物（降低表达），转染后观察Ihh，ColX，MMP9，MMP13等表达变化，这部分实验尚在总结中。本项目首次在国内外对关节软骨Mir-365表达进行了的全面研究，我们的结论有助于阐明力学因素导致骨关节炎的分子机制，也有助于针对骨关节炎的药物研发。