肺腺癌外周血肿瘤细胞（CTCs）检测平台的建立及其对肺腺癌转移风险和预后的评估

恶性肿瘤主要的致死原因是转移的发生和发展。新近发展的循环系统肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）检测法具有能够早期发现肿瘤转移及评价预后和判断治疗效果的优点。CTCs检测方法简便易行，容易在临床上广泛普及。非小细胞肺癌中肺腺癌的转移发生早、概率高、预后差。本项研究以肺腺癌的CTCs检测为突破点，通过建立小鼠的CTCs检测和研究模型,建立免疫磁珠和定量PCR检测肺腺癌CTCs的方法，并评估小鼠体内成瘤数量与CTCs数量的相关性。根据体外和动物实验建立的方法，检测临床各期肺腺癌（I-IV 期）患者的血液中的CTCs数量，建立一个高效检测肺腺癌血液中CTCs的技术平台。通过前瞻性研究还可对预测高转移风险的肺腺癌患者进行干预治疗或对治疗效果进行评估。因此，本项研究将为CTCs检测的基础研究和临床应用打下基础。

本课题分两部分完成：第一部分建立检测平台，进行初步评估：.首先利用多基因联合检测提高 CTC 检出率并验证它是否可以作为晚期肺腺癌患者疾病进展的预测因子。课题组收集68例晚期肺腺癌患者及30例健康人外周血，利用real-time RT-PCR方法对Survivin，hTERT，CK-7，TTF-1 基因表达水平进行检测。利用SPSS统计软件分析其表达水平与临床病理特征的相关性及对预后的影响。研究发现在68例肺癌患者外周血中，Survivin，hTERT，CK-7，TTF-1敏感性分别是41.18%，61.76%，41.18%，35.29%，四基因联合检测的敏感性是 82.35%，较单基因检测的敏感性明显增高。Survivin，hTERT, TTF-1 mRNA 的表达水平与淋巴结转移相关(p<0.05) ，四个基因的表达水平与疾病进展正相关（p <0.05）， 并且随着基因表达个数增加，疾病进展风险增大，无疾病进展生存期变短（p=0.000）。因此，我们认为实时定量荧光 PCR 检测肺癌患者外周血 CTC 是一种可靠、特异和敏感的方法。四基因联合检测 CTCs可能成为晚期肺腺癌患者潜在的分子标志物，预测患者的不良预后（论文于oncology letter杂志校样阶段）。第二部分：筛选适宜marker进行临床样本检测：首先对比I-III期肺腺癌患者与其癌旁组织，对比IV期肺腺癌患者及正常健康对照组的外周血，候选48个基因mRNA表达，将在这两组均显著上调的基因进行进一步分析。其次采集来自30个治疗前IV期肺腺癌患者和20名健康受试者血浆作为正常的控制。初步选出六个高表达的mRNA marker验证。四个有统计学意义显著升高的标记物HMMR、CLCA2、CK7、hTERT用于大规模临床检测。最后选择100例肺腺癌，100例非腺性非小细胞肺癌，48例健康受试者和48例肺部良性疾病的外周血作为样本进行检测并探讨CTCs与临床结果包括生存时间的关系。研究发现在非腺性非小细胞肺癌中CTCs的表达高于正常人，在肺腺癌患者中与分期成正比，三年随访发现,CTCs阳性患者生存时间短于CTCs阴性病人存活时间。CTCs上升病人比下降病人生存时间更短（文章投稿于CANCER-AM CANCER SOC杂志审稿中）。