基于质谱技术对胰腺癌病人血清蛋白位点特异性岩藻糖修饰的研究

Pancreatic cancer is one of the most malicious cancers. The earlier pancreatic cancer is diagnosed, the better is the prognosis. The ideal diagnostic marker should be able to distinguish pancreatic cancer patients from the people with high risk, such as with family pancreatic cancer, hereditary pancreatitis, obese, or type II diabetes etc. CA19-9 is the biomarker used clinically to diagnose pancreatic cancer. However, CA19-9 also increase in many non-pancreatic cancer diseases, such as pancreatitis, cystic fibrosis, obstructive jaundice, or diabetes but does not increase in some pancreatic cancer patients. The antibody of CA19-9 is able to recognize an antigen of glycan with fucosylation, sialyl Lewis A. This project will simplify the glycan structure of glycoproteins with sialidase/galactosidase double digestion and optimize mass spectrometry technology to screen for protein site-specific fucosylation as biomarkers for early pancreatic cancer using serum samples from patients of pancreatitis, type II diabetes, early and late stage pancreatic cancer which are not differentiated by CA19-9.The potential markers will be validated with MRM (multiple reaction monitoring）using yeast or cell line expressed isotopic labeled fucosylated peptide standards. Our approach will try to find site-specific fucoylation of serum proteins as biomarkers for early pancreatic cancer diagnosis.

胰腺癌是最致命的恶性肿瘤之一。病人的预后诊断和肿瘤的发现阶段密切相关。理想的诊断标志物应该区分胰腺癌病人和高危人群如有家族胰腺癌史、遗传性胰腺炎、肥胖或II型糖尿病等人群。糖抗原 19-9 （CA19-9）是目前临床使用的胰腺癌标志物，但它在胰腺炎、囊肿性纤维化、梗塞性黄疸和糖尿病等非癌症患者中也升高。CA19-9是岩藻糖修饰类型的一种。本课题拟通过借助唾液酸酶/半乳糖苷酶双酶切简化糖蛋白质的糖链并结合质谱技术的方法，对CA19-9检测无法区分的人群（包括胰腺炎、II型糖尿病、早期和晚期胰腺癌病人）中的血清糖蛋白质的岩藻糖修饰进行定性和相对定量分析，筛选出潜在的早期胰腺癌诊断标志物，并拟通过基因工程表达体系表达有岩藻糖修饰的肽段作为标准物对筛选到的潜在标志物进行基于质谱的高通量验证。本项目将实现蛋白质位点特异性岩藻糖修饰研究，以期找到临床诊断中可用的灵敏度高、特异性强的早期胰腺癌标志物。

本项目开发了应用质谱对人血清蛋白质岩藻糖修饰（蛋白质糖修饰的一种）的定性和定量研究方法，并将开发的血清蛋白质岩藻糖修饰的定性和定量方法应用到胰腺癌病人样品中，筛选早期胰腺癌的诊断标志物。首先，我们运用了HCDpdHCD MS3/CID MS2的质谱扫描策略对糖肽进行定性分析，同时我们解决了在质谱分析糖肽过程中避免源内裂解的问题，我们也开发了唾液酸酶和半乳糖苷酶双酶切糖链的方法，用于区分核心岩藻糖和末端岩藻糖修饰。之后，我们进一步建立了LC-HCD-PRM-MS 的质谱扫描策略进行糖肽的定量分析，使糖肽离子在复杂样品背景中实现高灵敏度、高选择性、高通量的自动定量，并比较了母离子水平定量和子离子水平定量两种定量方法在糖肽定量中的应用。在这个过程中，我们发现LC-HCD-PRM-MS的质谱扫描策略不仅可以用于岩藻糖修饰的定量分析，也可以用于糖肽同分异构体的定量分析。另外，我们也尝试利用植物表达体系生物合成岩藻糖修饰糖肽，探索应用该方法生产糖肽标准品实现对标志物糖肽绝对定量的可能性。本项目开发的糖肽定性和定量研究方法可以应用到其他任何基于糖肽的疾病标志物的筛选系统中，具有广泛的应用范围。