AKAP2 基因在青少年特发性脊柱侧凸发病中的作用与机制研究

Adolescent idiopathic scoliosis exhibits abnormal phenotype of skeleton development, which might be associated with endochondral ossification disorder causing abnormal longitudinal growth. In our previous study, we have found the mutation of AKAP2 gene in an AIS pedigree using exome sequence capture combined with second-generation sequencing technique, and cloned it successfully. Studies indicate AKAP2 have binding domain for PKA and other signaling molecules, might participate in the regulation of cell signaling pathway, and a high level of mAkap2 expression was detected in cartilaginous structures of the mouse embryo. Therefore, AKAP2 mutation might result in abnormal chondrocytes signaling pathway and change mode of endochondral ossification in AIS. In this project, using CRISPR-CAS9 system we generated Akap2 gene knockout mouse to further verify AKAP2 gene mutation might cause scoliosis. Meanwhile, we detect the mutation impact on signaling pathway proteins involved by bioinformatics analysis, to clarify the pathogenesis of AIS from the mutation of AKAP2.

青少年特发性脊柱侧凸 (AIS) 患者存在骨骼系统生长发育的异常表型，与软骨内成骨活跃为特征的骨纵向生长发育异常有关。课题组前期研究中收集了一个 AIS 大家系，采用外显子组序列捕获结合第二代测序技术，在 AKAP2 基因发现一个新的 AIS 致病突变并将其成功克隆。既往研究报道，AKAP2 存在蛋白激酶 A 及其它信号分子结合的区域参与调控相关细胞信号通路，并且mAkap2 在小鼠胚胎的软骨结构中高表达。AKAP2 基因突变可能造成软骨内的软骨细胞信号通路异常，引起生长板软骨内成骨模式改变进而发生AIS。本项目拟利用 CRISPR-CAS9 技术构建 Akap2 基因敲除小鼠，进一步验证 AKAP2 基因突变导致脊柱侧凸的发生；并利用生化信息学方法检测 Akap2 对小鼠生长板软骨细胞内相关信号通路蛋白表达的影响，以期初步阐明 AKAP2 基因突变导致 AIS 发生的作用机制。

青少年特发性脊柱侧凸 (adolescent idiopathic scoliosis, AIS) 是青少年时期最常见的脊柱三维畸形，AIS 患者存在骨骼系统生长发育的异常表型，与软骨内成骨活跃为特征的骨纵向生长发育异常有关。课题组将前期工作中发现的 AIS 致病基因 A-Kinase Anchoring Protein 2（AKAP2）基因列为靶向基因，利用 CRISPR/Cas9 基因敲除技术构建 Akap2 基因全身性敲除小鼠模型, 初步分析 Akap2 基因敲除小鼠的大体形态及脊柱侧凸等表型变化，验证 AKAP2 基因突变导致脊柱侧凸的发生；并利用生化信息学方法检测 Akap2 对小鼠生长板软骨细胞(growth plate chondrocytes, GPCs) 内ERK1/2通路蛋白的影响，以期初步阐明 AKAP2 基因突变导致 AIS 发生的作用机制。本项目研究结果显示，Akap2 基因敲除小鼠体重、躯干长、脊柱侧凸 Cobb 角度、脊柱椎体旋转和前后柱高度变化等各项观测指标均与野生型小鼠组差异无统计学意义（P>0.05）；组织学观察Akap2 基因敲除小鼠椎体终板软骨肥大区的厚度、细胞巢面积、巢内细胞数和增殖区细胞数也均与野生型小鼠组差异无统计学意义（P>0.05）；在分子水平，过表达 AKAP2 基因可加速GPCs增殖，提高细胞内 ERK1/2磷酸化水平、增加 PCNA、SOX9、ALP和Collagen II 蛋白的表达及沉积，并促进软骨细胞的钙化；而干扰 AKAP2 基因GPCs则出现相反的结果；ERK 抑制剂 U0126 能够减弱过表达 AKAP2 基因对细胞中 ERK1/2 磷酸化水平和细胞内相关蛋白表达及钙化的促进作用。这些结果表明AKAP2 基因突变可能影响细胞内ERK1/2 通路将细胞外信号向核内传导，引起GPCs增殖分化、凋亡和细胞外基质合成失控，改变正常的生长板软骨内成骨模式进而在 AIS 疾病发生中产生致病作用。