MYL9通过STX4调控血小板颗粒分泌的分子机制研究

Platelet transfusion is an important mean of clinical treatment. The treatment effect is influenced by the platelet storage lesion. The release of a granule in platelet is one phenomenon of platelet activation. The treatment effect could be improved by inhibiting the release of a granule. It is known that STX4, a SNARES member, and membrane protein MYL9 facilitate a granule release and control membrane fusion. Our early studies showed that the protein spectrum of platelet stored on 22 or 10 ℃ after 5 days were obviously changed with the expression of CD62p (a membrane protein of a granule), the expression and phosphorylation of MYL9, and the interaction with STX4. It is reported that the MYL9 could facilitate actin polymerization. Based on the phenomenon of MYL9 can affect the secretion of a granule, we suppose that MYL9 facilitate the secretion of a granule with STX4. We would observe the interaction between MYL9 and STX4, the related signal pathway and the interaction with the secretion of a granule. By these researches, the effects of MYL9 on the molecular mechanism of platelet a granule secretion might be clarified. Meanwhile, this project will provide a new idea for study on the inhibition activation of platelet or the research of new platelet additive solution to ensure the therapeutic effect.

血小板输注是临床救治的重要手段，但保存期发生的血小板活化严重影响疗效。a颗粒分泌是血小板活化的重要表现之一，有效抑制保存期间其分泌是临床输血研究关注的热点。研究表明SNARES系统促进a颗粒膜与浆膜融合以完成分泌，尤其是膜蛋白STX4在该过程中起了关键作用，但分子机制尚未明确。本项目组前期发现22℃或10℃保存5d后a颗粒膜特有蛋白CD62p在浆膜表达明显增加，MYL9及STX4总蛋白及其磷酸化水平变化显著，且免疫共沉淀显示二者存在相互作用，结合STX4与活化血小板F-actin在空间上存在相互作用及MYL9可引起actin聚集的研究进展，提出MYL9通过STX4调控a颗粒膜与血小板膜融合这一假说，拟在血小板贮存损伤过程中观察MYL9与STX4相互作用以及可能引起的信号通路变化，以证明MYL9通过STX4调控血小板a颗粒分泌，本项目的实施将为抑制血小板制剂活化或寻求新的保护剂研究提供思路。

血小板输注是临床救治的重要手段，但保存期发生的血小板活化严重影响疗效。α颗粒分泌是血小板活化的重要表现之一，有效抑制保存期间其分泌是临床输血研究关注的热点。本项目聚焦α颗粒分泌的分子机制主要从血小板保存过程中功能变化、血小板贮存损伤过程中MYL9 与STX4 相互作用以及与α颗粒分泌的关系、血小板贮存过程中MYL9与STX4相互作引起的信号通路变化三个方面开展了研究。首先，对血小板保存过程中的形态、代谢、颗粒分泌、活化功能变化研究明确了血小板在保存期末存活率有所下降，pCO2随保存时间显著下降，到第7天时为15.00±3.04 mmHg，pH为6.81±0.07，葡萄糖消耗明显，到第7天时浓度为11.19±3.54 mmol/L，LDH、HSR变化差异不具统计学意义。随保存时间延长，经ADP和肾上腺素诱导后其最大聚集率明显下降，凋亡蛋白Annexin V表达有所增加，于显微镜下对血小板进行形态评分其分值有所下降，变化具有统计学意义。血小板外泌体分泌随着保存时间延长浓度增高，第5天浓度为1.90×10¹¹ particles/ml，大小在120～130nm之间，血小板颗粒分泌标志物CD62P在第5天时达到（45.97±19.16）%，增加非常显著。其次，采用免疫共沉淀方法对0d、5d贮存期血小板MYL9和STX4相互作用进行研究，以STX4抗体沉淀MYL9，结果表明可将MYL9沉淀，说明MYL9与STX4存在相互作用；采用荧光共振能量转移实验观察到STX4标记的GFP可激发MYL9标记的dsRED，同样说明STX4与MYL9存在相互作用。最后，免疫印迹检测TACE，PKG，pCaMKⅡα，Kindlin-3，STX4，MYL9及p-MYL9，观察到在第3d时PKG表达有所增加。STX4随着保存期延长表达量增高，与颗粒分泌呈正相关。Kindlin-3可介导整合素αⅡbβ3活化从而引起血小板聚集，本实验结果发现在血小板保存过程中Kindlin-3随着保存期延长表达量随之增高。调控MYL9可影响PKG、pCaMKⅡα，Kindlin-3，STX4等蛋白表达的变化，这些重要的蛋白变化提示了其在血小板颗粒分泌中的作用。综上，本项目的发现为研究如何抑制保存期血小板活化或寻求新的保护剂研究提供了新的理论依据，对血小板临床应用具有重要意义。