大白菜芜菁花叶病毒病抗性基因TuRBCS01精细定位及图位克隆

Turnip mosaic virus (TuMV) is the main virus pathogen for Chinese cabbage in our country.A novel gene TuRBCS01 has been identified by us, and has been mapped on A04 of Brassica rapa genome between two EST-SSR markers SAAS_mDN192117a_159 (6.3 cM) and SAAS_mGT084561a_233 (6.1 cM). On the above basis, this project will make a fine mapping of gene TuRBCS01 to a domain of dozens kb using recombinant strains method by preparing a big segregating population with more than 2000 individuals and using sequence informations between the above two markers on B. rapa genome. Bioinformatics softwares will be used to find ORF in that domain。In order to gain target candidate genes, bioinformatic analysis and molecular biology verification will be done.The whole sequence of target genes will be amplified by PCR technology.Expression vectors containing target genes will be transformed into susceptible wild type Arabidopsis for functional complementation verification, and RNAi vectors containing target genes will be transformed into resistance parent material for function missing verification.The aim of this project is to lay a foundation for clarifying of molecular mechanisms of TuMV resistance in Chinese cabbage and development of marker-assisted selection of TuMV resistance in Chinese cabbage in the future.

芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）是危害我国大白菜的主要病毒。之前我们鉴定出一个新的大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01，并将该基因定位在白菜4号染色体上的两个标记SAAS_mDN192117a_159 (6.3 cM)和SAAS_mGT084561a_233 (6.1 cM)之间。本项目拟在此基础上，通过构建2000株以上的分离群体，利用白菜基因组序列信息，采用重组体法，将基因TuRBCS01定位在几十Kb的区域；利用软件查找该区域内的ORF,通过生物信息学分析与分子生物学验证，初步获得靶标候选基因；再利用PCR技术扩增靶标基因全长，通过连接到表达载体转入感TuMV的野生型拟南芥进行功能互补验证，连接到RNAi载体转入抗病亲本进行功能缺失验证。旨在为阐明大白菜抗TuMV分子机制和开展大白菜抗TuMV分子标记辅助选择奠定基础。

病毒病是我国大白菜的主要病害之一。芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）是危害我国大白菜的主要病原。之前我们 鉴定出一个新的大白菜TuMV抗性基因TuRBCS01，并将该基因定位在白菜4号染色体上的两 个标记SAAS_mDN192117a_159 (6.3 cM)和SAAS_mGT084561a_233 (6.1 cM)之间。本项目组在此基础上对基因TuRBCS01进行了精细定位与克隆。主要研究结果如下：.1 在前期研究的基础上，以BC1群体的157个单株为研究对象，用BSA法对基因TuRBCS01进行精细定位，结果表明，在目的区间内的31对SSR引物中，有三对在两亲本及抗、感池间扩出一致多态性，在8对InDel引物中，只有一对在亲本及抗、感池间扩出一致多态性，进一步通过群体验证和数据分析，将基因TuRBCS01定位在1.98Mb的区域，其中最近的两端标记分别为BrID10723与mBr4055。.2 利用在BrID10723和mBr4055两标记位点均扩增为杂合条带的F2单株10株自交构建F3分离群体。利用标记BrID10723和mBr4055对2495株F3群体单株进行PCR扩增，筛选交换株，共获得145株关键交换株。.3从白菜基因组网站http://brassicadb.org/brad/上下载定位区间内的序列信息设计SSR引物16对，并以两亲本基因组为模板进行扩增，得到三对有多态性的引物mBr4072、mBr4080和mBr4085。.4利用多态性引物mBr4072、mBr4080和mBr4085扩增上述145个交换株。结果表明基因TuRBCS01位于标记BrID10723的上游，标记mBr4085的下游。由此推断，基因TuRBCS01位于标记mBr4085和BrID10723之间，即A04：10,243,406-10,261,992之间18.586kb的区域。.5 利用白菜基因组网站http://brassicadb.org/brad/，对白菜A04：10,243,406-10,261,992（v1.5）区间内的基因进行搜索，结果表明，在该区间内有两个基因，分别为Bra030218和Bra030219。分别在两亲本中克隆上述两基因，结果表明，基因Bra030218在两亲本中扩增出的序列没有造成蛋白序列的变化。与基因Bra0