博落回中苄基异喹啉类生物碱代谢累积相关蛋白质研究

Macleaya cordata is a kind of very important medicinal plant resource for benzylisoquinoline alkaloids and has a well economy value. In the base of metabolism profile of different stage in Macleaya cordata , we focus on the root sample which the alkaloids most enriched and using the combine of the isotope tag and lable free techonolgy with the mass spectrum to analyze the proteins from plasma membrane and extracellular matrix. Then verify the location and fuction with Western blot，RT-PCR and immunocytochemistry of candidate proteins. We want to identify a set of cell surface receptor and plasma membrane proteins which occupy an important position of benzylisoquinoline alkaloids biosynthesis and transport. Then focus on 2-3 proteins which have special fuction in the pathway and find the molecular biology mechanism of benzylisoquinoline alkaloids biosynthesis and transport. Our reseach will shed light on the Macleaya coradata cultivation and target breeding.

博落回是一种重要的苄基异喹啉类生物碱来源植物并具有极佳的经济价值。本研究拟基于博落回不同时期的代谢累积数据，采用苄基异喹啉类生物碱累积量不同时期的根为样本，利用生物质谱技术结合同位素标记定量和非标定量技术对处于不同苄基异喹啉类生物碱累积阶段的博落回根的细胞质膜和细胞外基质蛋白进行鉴定和定量比较。筛选出一批与苄基异喹啉类生物碱合成和转运相关的质膜和细胞外基质蛋白质。在此基础上，运用Western blot，RT-PCR，免疫细胞化学技术对候选的功能蛋白进行进一步的验证和功能研究。期望获得一批与苄基异喹啉类生物碱合成和累积相关的细胞表面受体和蛋白,研究2-3种与调控苄基异喹啉类生物碱合成和累积相关的重要功能蛋白，进一步揭示博落回中苄基异喹啉类生物碱合成和累积的分子机制,对博落回植物的靶向改良，培育新的种质资源打下坚实的基础。

本研究基于博落回不同时期的代谢累积数据，结合转录组数据进行了SSR分析，对不同地区，不同时期，不同部位的样本进行了详细的比较分析，选择出了有代表性的植株；在此基础上结合了博落回的不同器官的切片和发育过程中的生物碱的组织化学定位，利用生物碱的自发荧光来对各根、茎、叶柄中的生物碱进行定位，发现其生物碱的位置与组织化学染色的部位吻合，并结合生物碱含量测定发现博落回各器官从植株出土开始就含有生物碱，且博落回中的这四种主要生物碱，除了在根与胚轴中呈现上升趋势，在叶、叶柄、叶片中均呈现下降趋势。从而判断根可能是博落回植物体内生物碱合成和储存的重要器官之一。.为了探讨博落回植物体内生物碱合成和存储的分子机制，基于以上结果，我们最终决定采用苄基异喹啉类生物碱累积量不同时期的根为样本，利用生物质谱技术结合iTRAQ同位素标记定量技术对处于不同苄基异喹啉类生物碱累积阶段的博落回根的全蛋白和质膜蛋白分别进行鉴定和定量比较并在差异蛋白质中筛选出了一批与苄基异喹啉类生物碱合成和转运相关的质膜和细胞外基质蛋白质。其中包括鉴定到了小檗碱桥酶（BBE）这个血根碱代谢途径中的关键酶，Vacuolar protein sorting 29，微管蛋白, α—分泌淀粉酶, 乳胶质醛缩酶蛋白和种子存储蛋白等。同时根据两相的比较，分泌蛋白中例如α—分泌淀粉酶在I相中获得了显著上调，相关的存储蛋白例如存储蛋白和Vacuolar protein sorting 29在II相中相对活性较高。这些蛋白质可能促进了特征生物碱的积累和转运在此基础上，运用了RT-PCR，免疫细胞化学技术对候选的功能蛋白和关键基因进行了进一步的验证和功能研究。.基于以上实验结果，我们获得一批与苄基异喹啉类生物碱合成和累积相关的细胞表面受体，关键酶和蛋白质。通过这些数据一方面进行了他们的下游功能的分析（特别是生物防治方面的应用功能和特异蛋白的挖掘），一方面通过同源BLAST分析与博落回转录组和基因组进行整合分析，找到了其中血根碱代谢中的一些关键酶(BBE,P6H,NCS)在基因组中的对应基因，此数据进一步揭示博落回中苄基异喹啉类生物碱合成和累积的分子机制,对博落回植物的靶向改良，培育新的种质资源打下坚实的基础。