人源CCR4-NOT复合物核心脱腺苷酸酶的结构与功能研究

The CCR4-NOT complex is an important regulatory protein complex in eukaryotes. It is linked to multiple functions, including transcription regulation, mRNA degradation, protein modification and ubiquitination. The CCR4-NOT complex is also linked to human cancer, heart disease and obesity. The human CCR4-NOT complex consists of two conserved deadenylase enzymes: CNOT6/6L and CNOT7/8. These deadenylases can remove the 3’ poly(A) (polyadenylic acid) tails of mRNA, separating mRNA from the protection by poly(A), finally leading to mRNA degradation and decreased gene expression. The mRNA degradation function of these core deadenylase substrates has attracted attention from many scientists. Recently, CNOT7 was shown to be a key driver of breast cancer metastasis and is a promising drug target to prevent metastasis in mouse models. However, the mechanism of degradation and regulation of CCR4-NOT deadenylase remains obscure and requires further structural and functional investigation. In this proposal, we will establish the structure-function relationships to clarify the biological roles of deadenylases from the CCR4-NOT complex. This will be done using a focused combination of molecular biology, biochemistry and structural biology approaches. We will characterize the in vitro deadenylase activity of CNOT6, CNOT6L, CNOT7 and CNOT8 for poly(A) substrates; determine their crystal structures in complex with the scaffold protein CNOT1, antiproliferative protein BTG2 or inhibitors; explain how these deadenylases bind CNOT1, BTG2 and inhibitors, or interact with other deadenylases and exert their synergistic activity together; elucidate the degradation and regulation mechanism for genes involved in cancer and other human diseases; and screen and design more efficient inhibitors based on their structures and functions. This project will provide crucial support for exploring the physiological function of CCR4-NOT deadenylases and their potential as drug targets.

CCR4-NOT复合物是真核生物中一类非常重要的调节蛋白，具有非常复杂的生物学功能，包括转录调节、mRNA降解、蛋白质修饰和泛素化过程，已经被证实与人类癌症、心脏病和肥胖症等多种疾病相关。其核心成员脱腺苷酸酶降解mRNA的功能一直是相关研究的重点，目前对于脱腺苷酸酶的降解机制和调节机理还不清晰，亟待更加深入的结构和功能研究。本项目以人源CCR4-NOT复合物的3种核心脱腺苷酸酶CNOT6L、CNOT7和CNOT8及其相关蛋白复合物作为研究对象，综合利用分子生物学、生物化学和结构生物学等多种研究方法，解析各种脱腺苷酸酶与支架蛋白CNOT1、抗增殖蛋白BTG2以及各种抑制物的复合物结构，分析其对底物多聚腺苷酸的降解活性，阐明结构与功能的关系，剖析其降解底物的作用机制，并根据结构和功能筛选设计高效抑制物，为探索其生理调节功能和可能的药物靶点提供重要帮助。

CCR4-NOT复合物是真核生物中一类非常重要的调控蛋白，具有转录调节、mRNA降解、蛋白质修饰和泛素化等多种重要生物学功能，与人类癌症、心脏病和肥胖症等多种疾病相关。其核心脱腺苷酸酶降解mRNA的机制一直是研究者关注的热点，至今脱腺苷酸酶的降解机制和调控机制仍不清楚。本项目以人源 CCR4-NOT 复合物核心成员脱腺苷酸酶 CNOT6L，CNOT7 和 CNOT8为研究对象，力求通过解析这三种脱腺苷酸酶与支架蛋白CNOT1截短体、抗增殖蛋白BTG2形成的各种复合物三维结构，以及它们与已有的和新设计的小分子抑制物的复合物三维结构，来阐明这些脱腺苷酸酶与底物、抑制物的结合方式，以及它们之间相互作用和协同发挥功能的分子机理，为进一步利用抑制物研究它们对癌症相关基因的调节作用，探索新的药物靶点和设计开发新型抗癌药物提供重要支持。本项目通过对人源CCR4-NOT复合物核心脱腺苷酸酶的结构与功能研究，解析了人源脱腺苷酸酶蛋白CNOT1-7-6L三元复合物的蛋白质晶体结构，并据此预测了完整的三元复合物的结构模型，利用脉冲电子顺磁共振(EPR)波谱的方法测定了三元复合物中CNOT6L核酸酶结构域与CNOT7中金属离子的距离，证实了结构模型的合理性，还纯化获得了CNOT6L截短体单体蛋白，CNOT1截短体蛋白与CNOT7全长及突变体蛋白的二元复合物，并进行了小分子抑制物的共结晶尝试，结合功能实验数据阐明了CNOT6L和CNOT7两种脱腺苷酸酶协同发挥功能的结构变化和作用机制。这些成果有助于深入研究真核生物的基因调控机制，为以结构为基础进行有效抑制物设计提供了重要支持，为癌症等基因调控相关疾病的新型药物靶点探索和药物研发奠定了基础，具有重要的创新性和实用价值。