黑皮质素4受体激活的C-Raf/ERK/CREB通路在nesfatin-1保护黑质多巴胺能神经元中的作用研究

Nesfatin-1 is a brain-gut peptide secreted by X/A like endocrine cells in the gastric glands, which could crosses the blood-brain barrier freely. Our previous study showed that nesfatin-1 protected dopaminergic neurons against MPTP induced neurotoxicity through the C-Raf/ERK-dependent anti-apoptotic pathway. But the receptor of nesfatin-1 on dopaminergic neurons in substantia nigra remains unknown. It has been reported that melanocortin 4 receptor（MC4R） is the possible receptor of nesfatin-1. In order to elucidate the receptor of nesfatin-1 on dopaminergic neurons and mechanisms underlying the protective effect, PD cell model and PD transgenic mice will be employed to observe the interaction between nesfaitn-1 and MC4R in substantia nigra, and the C-raf/ERK/CREB signaling pathway alteration induced by nesfatin-1. The alteration of the protective effect of nesfatin-1 on dopaminergic neurons will be further observed in MC4R or CREB silenced PD models to demonstrated that MC4R is the receptor of nesfatin-1 on dopaminergic neurons, and the protective effect of nesfatin-1 on dopaminergic neurons is mediated by C-Raf/ERK/CREB signaling pathway through MC4R.

Nesfatin-1是胃底X/A细胞分泌的一种能自由通过血脑屏障的脑肠肽。我们前期工作表明nesfatin-1通过激活C-Raf/ERK途径对MPTP制备的帕金森病（PD）小鼠发挥保护作用，但nesfatin-1在黑质多巴胺（DA）能神经元上的受体至今未见报道。有研究提示黑皮质素4受体（MC4R）可能是nesfatin-1受体之一。为深入阐明nesfatin-1神经保护作用机制，本研究拟首先在PD细胞模型和PD转基因小鼠黑质上观察nesfatin-1与MC4R的结合情况，及C-Raf/ERK/CREB通路的激活与nesfatin-1保护作用的相关性；慢病毒沉默MC4R和CREB后，再观察nesfatin-1保护作用的改变。本研究有望首次鉴定出DA能神经元上nesfatin-1的受体MC4R，并阐明MC4R激活的C-Raf/ERK/CREB通路在nesfaitn-1保护DA能神经元中的作用。

Nesfatin-1是2006年发现的一种含有82个氨基酸的脑肠肽，主要由胃底X/A样细胞分泌，对其生物学功能的研究尚处于起步阶段。Nesfatin-1可自由通过血脑屏障，为外周用药在中枢发挥作用提供了可能。本研究拟阐明nesfatin-1对中脑黑质多巴胺（DA）能神经元的保护作用、相关机制及nesfatin-1在黑质DA能神经元的受体是否为黑皮质素4受体（MC4R）。主要结果包括：①在1-甲基-4-苯基吡啶阳离子（MPP+）处理的MES23.5细胞上，预先应用C-Raf、ERK1/2抑制剂，转染cAMP反应元件结合蛋白（CREB）-shRNA慢病毒颗粒可消除nesfatin-1对MPP+诱导的MES23.5细胞活性下降、线粒体功能损伤、细胞凋亡的保护作用，提示nesfatin-1对MES23.5细胞的保护作用与C-Raf/ERK/CREB通路有关。免疫荧光双标记法检测到MES23.5细胞上黑皮质素4受体（MC4R）的表达，但蛋白免疫共沉淀法未能检测到nesfatin-1与MC4R的相互作用，提示nesfatin-1对MES23.5细胞的保护作用与MC4R无关。②侧脑室注射nesfatin-1进行干预，能够拮抗1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的小鼠黑质（SN）区多巴胺能神经元数目下降、小鼠纹状体区DA及其代谢产物含量下降，DA能神经末梢纤维数目的降低。虽然中脑黑质检测到MC4R的表达，但预先应用MC4R抑制剂不能消除nesfatin-1对黑质多巴胺能神经元的保护作用，提示nesfatin-1对中脑黑质多巴胺能神经元的保护作用与MC4R受体无关。③侧脑室注射anti-nesfatin-1抗体能够引起脑脊液nesfatin-1含量降低，造成中脑黑质致密带DA神经元数目减少，纹状体多巴胺及其代谢产物含量降低，凋亡相关蛋白表达上调，并引起脑源性神经营养因子（BDNF）含量代偿性升高，说明nesfatin-1在维持黑质纹状体系统正常生理功能中发挥重要作用。C57BL/6小鼠预先应用MC4R抑制剂不能引起黑质纹状体系统的损伤，进一步说明nesfatin-1维持黑质纹状体系统正常生理功能的作用和MC4R受体无关。以上结果证明脑肠肽nesfatin-1能够通过激活C-Raf/ERK/CREB通路对中脑黑质巴胺能细胞发挥保护作用，该作用与MC4R受体无关。