hDaxx在人乳头瘤病毒16型E6蛋白致癌中的作用及其机制研究

本项目在HPV16 E6蛋白与hDaxx相互作用的基础上，构建E6等载体，利用酵母双杂交系分析相互作用的结构域；共免疫沉淀反应或染色质免疫沉淀分析hDaxx与E6蛋白或基因的结合反应。通过间接免疫荧光试验和图像软件等分析E6蛋白、hDaxx与PML在细胞内的分布与定位或共定位，确定E6蛋白高表达时hDaxx由胞核向胞浆转位，研究E6对hDaxx定位及其与PML共定位的影响。应用瞬时DNA复制分析hDaxx对HPV16 DNA复制的影响。用hDaxx-/-或不含P53的细胞，研究E6对hDaxx转录调控作用的影响，RQ-PCR检测hDaxx水平，通过caspase-3分析E6与hDaxx相互作用参与的凋亡信号通路，拟初步建立是否依赖P53由hDaxx参与的HPV16 E6致癌新机制，即"E6←P53？→hDaxx→→Fas→Ask1→JNK→→Caspase-3→apoptosis"通路。

宫颈癌与高危型人乳头瘤病毒（HPV）密切相关，HPV16 E2、E5、E6和E7也成为人们研究HPV16诱发宫颈癌致病机制及防治措施的重要蛋白。Daxx与PML在PML-NBs共定位能维持其形态与功能。Daxx与多种细胞或病毒蛋白相互作用，调节病毒的复制，影响病毒早期蛋白的合成和病毒的感染性，具有细胞内抗病毒作用。在证实Daxx与HPV16 E6相互作用的基础上，本研究构建了一系列表达载体，利用酵母双杂交试验分析与E6相互作用的Daxx结构域、E2与Daxx的相互作用；免疫共沉淀试验分析Daxx与E6或E2的结合反应。通过间接免疫荧光试验及共聚焦显微镜等观察分析Caski或HeLa细胞内Daxx和PML等蛋白质的定位与共定位。探讨HPV16 E2高表达对巨噬细胞分泌细胞因子及细胞凋亡的影响。结果显示：DsRed-HPV16 E6 和 EGFP-Daxx能在HeLa细胞中表达，且E6使部分Daxx从细胞核转位至细胞浆，两者发生共定位；在Caski细胞，Daxx与HPV16 E6共定位于胞浆与胞核；在HeLa细胞和Caski细胞，PML主要分布于细胞核、定位PML-NBs，Daxx在胞核和胞浆呈弥散样均匀分布，但PML与Daxx没有发生共定位。HPV16 E6可抑制TNF-α诱导的细胞凋亡，而Daxx高表达可使高表达E6的HeLa细胞对TNF-α的敏感性增强。E6抑制TNF-α诱导caspase-8和caspase-3活化，Daxx能下调该作用。细胞内HPV16 E6与Daxx发生结合反应，且Daxx通过C端115个氨基酸残基与E6结合发生相互作用。GFP-HPV16 E2主要定位巨噬细胞胞核，GFP-TAD定位细胞浆，GFP-DBD定位胞核；E2及其TAD高表达上调巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β，并使其凋亡率明显增高，说明E2 TAD是其主要功能结构。E2与Daxx共定位Caski细胞胞核与胞浆，且主要定位胞浆；Daxx在细胞内外直接与 E2结合，两者发生相互作用。本研究结果说明，Daxx能与HPV16 E6或E2发生相互作用，而HPV16、18某些蛋白质打破了Daxx与PML在PML-NBs的共定位，必将影响两者的生物学活性。我们将进一步研究Daxx与E6或E2相互作用在HPV16致宫颈癌中的作用及其机制，以便证实Daxx是防治宫颈癌的重要靶点之一。