牛乳α(s1)-酪蛋白与大豆蛋白交叉过敏原的关键氨基酸的致敏特性

The universality and complexity of food cross-reactive allergy increase the prevalence of food allergy, also increase the difficulties of establishing an accurate and efficient detection method for quantitative allergens and developing low allergic products. Cow milk and soybean belong to the eight major food allergens, it is important to identify cross-reactive allergens of cow milk α(s1)-casein and soybean proteins, and find B cell epitopes and the critical amino acids for revealing the mechanism of food cross-reactive allergens. In this project, firstly, the cross-reactive allergens of α(s1)-casein and soy proteins will be predicted by bioinformatics. Then, the cross-reactive allergens will be identified using sera from cow milk α(s1)-casein allergic patients and mouse monoclonal antibodies in order to verify the prediction results. Moreover, the peptide library will be constructed by solid phase synthesis, and the B-cell epitopes of cross-reactive allergens will be identified by enzyme-linked immunosorbent assay, in addition, the B cell epitopes results will be screened by mouse immunization test and histamine release test. Finally, the critical amino acids will be identified by “alanine scanning analysis”, then, the critical amino acids results will be screened and identified by immunizing mouse with “missing” key amino acid peptides, and the levels of specific IgE, histamine and cytokines, etc., were used as evaluation indexes. The conclusions will reveal the molecular mechanism of cross-reactive allergens.

食物交叉过敏的普遍性和复杂性增加了食物过敏发生的概率，同时增加了建立精确高效的过敏原定量检测方法及开发低过敏食品的难度。牛乳和大豆属于八大食物过敏原，识别牛乳α(s1)-酪蛋白和大豆蛋白的交叉过敏原，进而找到B细胞表位及关键氨基酸，对揭示食物交叉过敏机理具有重要的意义。本项目首先通过生物信息学技术预测α(s1)-酪蛋白与大豆蛋白的交叉过敏原，进而以牛乳α(s1)-酪蛋白过敏患者血清及小鼠单克隆抗体为探针，通过免疫印迹方法识别大豆蛋白交叉过敏原，验证预测结果。再通过固相合成法构建多肽库，应用酶联免疫方法识别交叉过敏原B细胞作用表位，并通过小鼠免疫试验和组胺释放试验验证B细胞作用表位的致敏特性，筛选确定最终结果。并进一步通过“丙氨酸扫描技术”识别B细胞作用表位的关键氨基酸，进而用“缺失”关键氨基酸的多肽免疫小鼠，以特异性IgE抗体、组胺、细胞因子等为评价指标，验证确定关键氨基酸。

食物过敏原的免疫交叉反应机制一直是食品过敏学领域的重要研究课题，识别验证交叉过敏原，分析其结构与致敏特性的关系，对于过敏原检测、诊断以及过敏原脱敏疫苗设计，指导过敏患者合理饮食，开发新型低过敏食品、合理有效的避免交叉过敏反应的发生均具有重要的意义。本项目首先通过生物信息学技术预测αs1-酪蛋白与大豆蛋白的交叉过敏原，进而以牛乳αs1-酪蛋白过敏患者血清及小鼠单克隆抗体为探针，通过免疫印迹方法识别大豆蛋白交叉过敏原，验证预测结果。进而通过固相合成法构建多肽库，应用酶联免疫方法识别交叉过敏原B细胞作用表位，并通过小鼠免疫试验和组胺释放试验验证B细胞作用表位的致敏特性，筛选确定最终结果。并进一步通过“丙氨酸扫描技术”识别B细胞作用表位的关键氨基酸，进而用“缺失”关键氨基酸的多肽免疫小鼠，以特异性IgE抗体、组胺、细胞因子为评价指标，筛选确定关键氨基酸。结果表明：αs1-酪蛋白与大豆蛋白交叉过敏原为β-伴大豆球蛋白α亚基（Gly m Bd 60K)。αs1-酪蛋白序列AA49-71和AA112-130，大豆Gly m Bd 60K的序列AA319-341、AA71-104、AA441-480、AA164-182、AA251-280和AA361-401为交叉B细胞作用表位。αs1-酪蛋白的第67位的谷氨酰胺（Q67）和第115位的精氨酸（R115），大豆Gly m Bd 60K的第336位的苏氨酸（T336）和第171位的酪氨酸（Y171）为交叉过敏原B细胞作用表位的关键氨基酸。 研究结论为深入揭示食物交叉过敏原致敏的分子机制提供重要理论依据。