人端粒酶逆转录酶辅助活化FOXM1促进ITGB1表达的分子机制及其在胃癌侵袭转移中的作用研究

It has been reported that human telomerase reverse transcriptase (hTERT) promotes tumor metastasis, but the mechanism is unclear. We found that hTERT enhanced the invasion of U2OS cells (hTERT negative) in the previous study; Proteomics demonstrated that ten invasion-related genes were increased more than five times in hTERT overexpression group, but qPCR and WB showed that only ITGB1 was up-regulated in U2OS and gastric cancer cells. Dual luciferase report assay verified that hTERT increased the activity of the promoter of ITGB1.Moreover, (Co-Immunoprecipitation) Co-IP showed that hTERT could interact with FOXM1, bioinformatics suggests that there is a FOXM1 binding site during ITGB1 promoter region.Taken together, we hypothesize that hTERT induce ITGB1 expression and eventually promote gastric tumor invasion via activation of FOXM1. We would like to further confirm whether ITGB1 is a novel target gene of FOXM1 using duel luciferase reporter assay, electrophoresis mobility shift assay (EMSA) and Chromatin Immunoprecipitation (ChIP). Moreover, we will also investigate the importance of FOXM1 in the hTERT-mediated upregulation of ITGB1 by knockdown of FOXM1 to clarify the mechanism of hTERT-mediated tumor invasion. Our study may provide a new theoretical basis on targeting hTERT for treatment of gastric cancer.

文献及课题组的研究表明人端粒酶逆转录酶(hTERT)可促肿瘤转移,但机制不清。我们前期预实验发现hTERT过表达可促进端粒酶阴性的U2OS细胞侵袭转移;蛋白组学研究证实hTERT过表达组中10个侵袭转移相关基因上调超过5倍, qPCR和WB证实在U2OS和胃癌细胞中只有ITGB1都上调;双荧光素酶实验进一步研究发现hTERT可促进ITGB1启动子活性;免疫共沉淀(Co-IP)发现hTERT与FOXM1存在蛋白相互作用,生物信息学预测到ITGB1启动子区有FOXM1的结合位点。据此提出“人端粒酶逆转录酶辅助活化FOXM1促进ITGB1表达及胃癌侵袭转移”的假说。本研究拟采用双荧光素酶实验EMSA、和ChIP证实ITGB1是否为FOXM1的靶基因；干扰FOXM1以证实其在hTERT促进ITGB1表达中的作用,以阐明hTERT促胃癌转移的分子机制,为以hTERT为靶点的胃癌治疗提供新的依据。

据统计，全球每年新发胃癌93.4 万例，且每年约有70 万人死于胃癌。胃癌的预后与病期密切相关,Ⅰ期胃癌切除后5 年存活率为93%-98%, 而Ⅳ期只有19%左右，故癌细胞侵袭转移是造成胃癌死亡的主要原因。因此，探索胃癌浸润、转移机制，对防治其侵袭转移具有极其重要的现实意义。在胃癌侵袭转移过程中，端粒酶逆转录酶（hTERT）发挥重要作用。hTERT 是端粒酶的一种催化亚单位，其表达完全可以代表端粒酶的活化。既往传统研究主要集中在hTERT维持细胞端粒长度、促进细胞无限增殖方面。本课题前期研究发现在端粒酶阴性的U2OS中过表达hTERT明显促进其体内外侵袭转移 (Int J Oncol.2009)；meta分析发现，端粒酶及其亚单位hTERT 的活化与胃癌患者肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、远处转移等临床病理特征密切相关，证明端粒酶及其hTERT 亚单位在肿瘤的侵袭转移过程(Exp Ther Med. 2012)中发挥十分重要作用，而具体分子机制不清。充分阐明hTERT诱导胃癌侵袭转移的分子机制，将为靶向hTERT防治胃癌的侵袭转移、延长胃癌患者生存提供新思路。. 本研究充分运用蛋白组学, Ch-IP-qPCR, Co-IP,免疫荧光技术,凝胶电泳迁移阻滞实验, 泛素化研究等系列分子生物学技术，系统深入阐明了hTERT通过叉头盒蛋白M1（FOXM1）以及叉头盒蛋白O3(FOXO3a)双信号通路，促进整合素β1(ITGB1)表达，进而促进肿瘤细胞与基底膜粘附及侵袭转移的分子机制 (Gut, 2017)，主要发现：.1.hTERT通过促进ITGB1的表达进而促进胃癌细胞粘附与侵袭;2.hTERT促进ITGB1的表达由FOXM1和FOXO3a双通路共同介导;3.hTERT调控ITGB1主要是通过抑制FOXO3a从而解除FOXO3a对ITGB1的负调控;4.hTERT依赖于MDM2介导FOXO3a泛素化降解;5.“hTERT-FOXO3a-ITGB1”通路促进胃癌细胞在小鼠体内侵袭转移;6.胃癌组织中的hTERT与FOXO3a、ITGB1均有相关性, 对上述三个指标联合应用分析，可以更好地用于评价患者的生存时间: hTERT、ITGB1均高表达且FOXO3a低表达患者生存时间最短。上述研究提示靶向hTERT/MDM2-FOXO3a-ITGB1为防治胃癌侵袭转移新策略。