杨树抗坏血酸过氧化物酶（APX）基因家族成员调控杨树抗逆能力的分子机制

抗坏血酸过氧化物酶(APX，EC1.11.1.11)是以抗坏血酸(AsA)为电子供体的一种过氧化物酶，是植物体内尤其是叶绿体中清除H2O2的关键酶。本项研究首先分析杨树中APX基因的种类与组成，以及不同类型APX基因的拷贝数目、基因结构、在整个基因组中的分布等科学问题；然后从杨树中克隆各APX基因家族成员序列，利用E.coli进行原核表达，从表达产物中纯化APX蛋白，对所纯化的APX蛋白进行酶生化特性研究以及酶动力学研究；同时，分别分离杨树中各APX基因家族成员的启动子序列，分析在不同逆境胁迫下各APX基因启动子的表达调控模式。在此基础上，构建含杨树APX基因的转基因表达载体并转化杨树、烟草等植物，分析APX基因过量表达提高植物抗逆能力的机制。从而最终揭示杨树中APX基因家族成员的数量、种类及其在应对胁迫中的不同作用，并成功获得具有较高抗逆能力的转基因树木。

本研究的主要目的是对杨树抗坏血酸过氧化物酶（APX）基因家族各成员调控杨树抗逆能力的分子机制进行研究。结果发现,杨树中存在9个APX基因（Ⅰ～Ⅸ），从741毛白杨中分别克隆得到这9个APX基因的cDNA序列。进一步分析发现，杨树APX基因Ⅳ和Ⅴ的核苷酸序列一致性高达99.2%，其理化性质也高度趋同，二者可能为等位基因。利用原核表达系统在E. coli中分别表达、纯化8种APX蛋白，并对其进行酶生化特性和酶动力学分析，结果显示各种APX酶对底物H2O2的亲和力均高于对底物抗坏血酸的亲和力，催化活性最高的两种酶是APX3和APX5；不同APX酶的最适pH和最适温度存在一定的差别。通过TAIL-PCR方法，对毛白杨APXⅡ、Ⅲ、Ⅶ和Ⅸ四个基因的启动子序列进行克隆，得到了Ⅱ、Ⅶ和Ⅸ三个APX基因启动子的部分序列，长度分别为331 bp、322 bp和299 bp。分析发现，这三个APX基因的启动子序列除了都含有启动子的基本元件，还存在一些特殊的调控元件。通过农杆菌介导法获得过量表达8个毛白杨APX基因和反义表达8个APX基因的转基因烟草，结果发现过量表达毛白杨APX基因可明显提高转基因烟草的抗干旱能力、耐盐胁迫能力和抗氧化胁迫能力，反义表达毛白杨APX基因则降低转基因烟草对干旱、盐胁迫和氧化胁迫的耐受性。进一步将APX基因的重组表达载体转入杨树，成功获得过量表达APX基因的转基因杨树，测试结果表明，过量表达APX基因可增强杨树的抗旱性，提高杨树对盐胁迫、氧化胁迫的耐受性，经筛选获得了具有较高抗逆能力的转基因杨树。本研究表明，APX基因在杨树中是以一个基因家族的形式存在，在体外生化功能方面存在一定的差异，预示其在体内的作用或分工可能不尽相同，从而以不同的表达调控模式参与杨树抗逆能力的调控。