基于内皮细胞全基因组CRISPR/Cas9文库研究温经通络汤干预膝骨关节炎作用机制

The Wen-Jing-Tong-Luo decoction is a well-practiced Traditional Chinese Medicine(TCM ) Combination aiming on the Jing-Luo-Bi-Zu TCM syndrome with reliable curative effect. Based on the previous research, WJTLT could increase the collagen secretion, sustain matrix metalloproteinase and vasoactive factors. On the other hand, multiple studies showed the critical role of angiogenesis and vascular invasion on inducing the osteoarthritis in combination with other signal pathways. Our pilot research results also found the importance of angiogenesis as a potential therapeutic target of WJTLT. Hereby, we come up with a hypothesis that WJTLT could attenuate osteoarthritis through rein the angiogenesis progress. For the restriction of low efficiency of single point knock-out model, we introduced the screen method of a high-throughput endothelial genomic CRISPR/Cas9-sgRNA Library, which could possibly be the first shot in TCM research domain. This research could profile the genomic signaling mechanism of TCM Wen-Tong therapy and clarify the molecular targets of TCM Bi-Zu syndrome. No doubt with be addressed on the great value of research findings on extending human’s understanding of ancient TCM Jing-Luo-Bi-Zu syndrome and its correspondence therapy ”Wen-Jing-Tong-Luo”.

温经通络汤是针对膝骨关节炎（KOA）“经络痹阻”病机而设定的处方，经长期临床应用，疗效确切。本方在前期实验研究中，其可通过调控胶原蛋白消长，抑制炎症反应，减少血管活性物质释放，干预骨关节炎病理进程。目前国内外研究表明，在骨关节炎早期内皮细胞激活，毛细血管异常侵袭并偶联多条信号通路，导致KOA进一步发展。本课题组预实验发现，本方恰可抑制内皮细胞增殖，阻止毛细血管侵袭，提供了阐明本方作用机制研究的新思路。鉴于温经通络汤具有多靶点调控的特点，而现有单一靶点基因敲除技术难以全面反映其调控内皮细胞的分子机制，本研究即在中医药复方研究领域首次采用CRISPR/Cas9-sgRNA 全基因组文库新技术，用以探明本方如何通过编码与非编码基因靶点群的复合信号，来调控内皮细胞VEGF/HIF1Alpha激活状态，进而调节内皮细胞因子释放，抑制毛细血管侵袭，从而科学探明温经通络汤干预KOA的作用机制。

温经通络汤是针对膝骨关节炎（KOA）“经络痹阻”病机而设定的处方，经长期临床应用，疗效确切。运用ACLT造模方法成功构建了小鼠膝骨关节炎模型，通过观察术后不同病理阶段骨关节炎病变程度和血管生成情况验证了ACLT模型有效以及明确了小鼠早期膝骨关节炎的时间点。模型构建成功后，运用磁珠分选技术，从早期膝骨关节炎小鼠的膝关节中成功分离并培养了原代血管内皮细胞。通过CCK8、细胞划痕、细胞迁移和成管腔实验证实温经通络汤可有效抑制小鼠膝关节血管内皮细胞的增殖、迁移和成管腔过程。人脐静脉内皮细胞目前已被用作研究内皮生理学和血管生成的细胞模型，与来源于动物的内皮细胞相比，实验条件和结果更符合人体情况。在验证了温经通络汤干预后的人脐静脉内皮细胞在细胞表型和功能方面与小鼠膝关节血管内皮细胞均有一致性后，我们运用蛋白组学方法定位于温经通络汤干预后的差异蛋白，并发现其主要与内皮细胞增殖正/负调控、血管新生正调控、凋亡过程负调控、细胞外基质结合、铁死亡等信号通路相关。完成了CRISPR/Cas9全基因组文库的构建及相关测序工作后，我们发现温经通络汤含药血清干预小鼠膝关节血管内皮细胞前后差异基因涉及的信号通路主要包括细胞进程、细胞内环境、遗传信息、人类疾病、细胞代谢、有机系统6各方面。以上结果与蛋白组学研究结果中已明确的相关信号通路（细胞增殖、凋亡、细胞外基质结合）存在较高的一致性。课题组进而筛选了主要差异蛋白VEGF-A、VEGFR2，验证相关蛋白在温经通络汤调控血管生成，干预KOA进程中的作用及机制。通过分子生物学实验证实了温经通络汤可通过调控HIF1、VEGF和PI3K-AKT信号通路，抑制膝关节中血管内皮细胞的侵袭，维持膝关节表面软骨的稳定，从而延缓膝骨关节炎的进程。