Tmem182基因异常甲基化与高糖环境导致心肌细胞凋亡和心脏发育异常的相关性及作用机制研究

Diabetes mellitus in pregnancy is one of the maternal diseases that cause congenital birth defects in infants. However, the underlying molecular mechanism remains unknown. In our study, pregnant Rats with diabetic mellitus were generated and the cardiac tissue of fetal rats were gained for RNA-sequencing and MethylRAD- sequencing analysis. The results showed the expression of DNA methyltransferase Dnmt3L increased in the heart tissue of diabetic offspring compared with controls, Meanwhile, the down regulation of Tmem182 expression was associated with the increase methylation level of its promoter region in heart tissue of diabetic offspring compared with controls. Based on our finding and related studies, On the one hand, the transcriptional mechanism of Tmem182 by Dnmt3L, Dnmt3a, Dnmt3b and transcription factor MEF2A was investigated by molecular biological techniques. On the other hand, the role and molecular mechanism of Tmem182 and its downstream gene CX43 in cardiomyocyte apoptosis and abnormal heart development by RNAi and CRISPR/Cas9 technology respectively. We will collect blood samples to explore whether Dnmt3L abnormal expression and Tmem182 gene methylation change are related to CHD genesis. These results will provide some experimental basis for the possibility of the genes in diagnosis of CHD.

母亲妊娠期糖尿病是导致儿童先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)发生病因之一,但致病机制未阐明。我们建立高血糖妊娠大鼠模型，取胎鼠心脏组织进行转录组测序和MethylRAD全基因组甲基化分析,发现高糖组胎鼠心脏组织中DNA甲基化转移酶Dnmt3L表达增加,Tmem182表达下调过程中伴随其启动子区甲基化升高。本项目拟在此基础上,一方面,利用分子生物学方法研究Dnmt3L,Dnmt3a或Dnmt3b对Tmem182甲基化调控模式, 探索这种甲基化改变对MEF2A在Tmem182调控中影响;另一方面,我们通过RNAi和CRISPR/Cas9技术分别在体外和体内研究Tmem182及其下游基因CX43在心肌细胞凋亡和心脏发育中作用;结合临床样本,我们初步探索Tmem182基因甲基化改变与CHD发生相关性，为其作为妊娠期糖尿病导致CHD发生早期诊断提供前期基础。

以往研究发现，母亲妊娠期糖尿病（Gestational Diebetes Mellitus,GDM）是导致胎儿先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)发生重要病因之一, 但致病机制尚未阐明。我们建立高血糖妊娠大鼠模型，通过高通量测序筛选出Tmem182、Mst1和Sox11等为候选基因进行深入研究。对于Tmem182基因来说，我们先通过qRT-PCR、Western blot等生物学实验证实Tmem182低表达与高糖环境诱导的胎心发育异常相关，并利用质粒构建、双报告等技术阐明高糖环境下转录因子MEF2a对Tmem182异常表达的调控机制；还通过CRISPR/Cas9技术成功获得并繁殖Tmem182基因敲除鼠，明确Tmem182基因敲除对胎心影响及下游效应基因Cx43、S100A8等基因及MAPK10信号通路在胎心发育异常中的作用机制。我们还发现高糖环境下，Mst1表达增加,Sox11表达降低和Gsk3β（Ser9）磷酸化降低与高糖诱导心肌细胞凋亡及心脏发育异常密切相关，分别通过过表达/干涉和相关信号通路激活剂/抑制剂阐明这些基因在高糖诱导心肌细胞凋亡和心脏发育异常中具体作用机制，这些实验结果汇总一起，有望形成高糖环境影响心脏发育的调控网络。与此同时，我们取胎心组织进行MethyRad全基因组甲基化测序，结果显示，高糖环境下，CCGG/CCNGG位点的甲基化主要在常染色体上，甲基化位点多富集在基因间、内含子、外显子、上游调控区域,在5’端和3’端非翻译区分布相对较少些。GO和KEGG功能分析结果显示，在上游调控区域发生甲基化的改变的基因主要涉及参与基因转录、细胞增殖与凋亡调控、蛋白结合和细胞因子介导的信号通路等重要生物学过程。另外，胎盘结构功能异常是导致胎心发育异常的重要原因之一，我们还深入研究高糖对胎盘结构影响及相关基因表达情况，我们实验结果显示，高糖环境下，胎盘重量增加，胎盘中间层明显增厚。深入研究发现S100A8和Nodal等基因在高糖影响胎盘发育异常起重要的调控作用；我们还收集临床样本，初步探索以上S100A8和Tmem182等这些基因的异常表达是否与GDM和CHD等疾病发生的相关性，以上实验结果有利于揭示高糖环境下胎心发育异常的分子机理，为Tmem182、Sox11和S100A8等基因作为治疗靶点和早期诊断标志提供了新思路。