家蚕氨肽酶N3与口服感染因子P74相互作用介导杆状病毒ODV入侵中肠细胞分子机制研究

P74 is the key per os infectivity factor of baculovirus during the primary infection. However, it is still unclear that which factor can interact with P74 to initiate occlusion-derived virus (ODV) invading into host midgut cells. As a result, discovering the factor binding with P74 is very important to the study on the mechanism of baculovirus peroral infectivity. The data of Bombyx mori whole genome sequences and EST library is useful to identify the gene expressed in silkworm midgut binding with P74. So we select the ideal materials: silkworm and BmNPV which specific infecting B.mori for finding the P74 binding partner. Six polypeptides were found to bind with P74 using a random 15mer phage display library for biopanning P74. Three of them were high homologues to APN3, APN4 and APN5 of B.mori aminopeptidase N family。APN3 binding with P74 in vitro was further proved. Furthermore, the infectivity of occlusion bodies was partially inhibited by the purified recombinant APN3. It indicated the APN3 plays an important role during ODV infection. In this project, we will study the interaction between Bombyx mori aminopeptidase N3 and P74, as well as the function of interaction during ODV invasion. We aim to identify APN3 binding with P74 in vivo, study the interaction between P74 lysis fragments with APN3 , prove and improve the hypothesis of P74 interaction with APN3 medicating ODV invasion into midgut epithelial cells proposed by us, discover the molecular mechanism of baculovirus primary infection and provide a novel target gene for silkworm resisting baculovirus infection.

P74蛋白是杆状病毒初级感染的关键口服感染因子，但P74与何种因子相互作用以触发ODV入侵宿主中肠细胞依然未知。寻找与P74相互结合因子对研究杆状病毒口服感染机制十分重要。家蚕全基因组序列及其EST数据库有利于鉴定家蚕P74结合基因，因此以家蚕及相应杆状病毒BmNPV为材料来寻找P74结合因子。用噬菌体表面展示技术获得6个与BmP74结合的15肽，其中3个多肽序列和家蚕氨肽酶N家族的APN3，APN4和APN5同源性较高。APN3不仅能与BmP74体外结合，而且纯化的APN3重组蛋白能部分竞争性抑制包涵体病毒对家蚕幼虫感染，提示APN3在ODV感染中起到重要作用。本项目拟研究P74 蛋白与家蚕中肠APN3相互作用的具体方式及其在ODV入侵中的功能，验证和完善所提出的P74与APN3相互作用介导ODV入侵中肠细胞的分子假说，揭示杆状病毒口服感染分子机制并为家蚕抗杆状病毒感染提供新靶标。

在杆状病毒初级感染过程中，包涵体病毒表面的P74蛋白是口服关键感染因子，但P74与何种因子相互作用以触发ODV入侵宿主中肠细胞依然未知。本研究以家蚕及相应杆状病毒BmNPV为对象、通过噬菌体表面展示技术分析和体外结合实验发现BmP74蛋白能和家蚕氨肽酶N家族的APN3特异性结合，提示APN3在ODV感染中起到重要作用。构建了稳定表达APN3全长基因的稳定细胞系BmN-apn3full以在细胞水平上验证P74蛋白和家蚕中肠APN3的相互作用方式。表达的可溶性P74全长蛋白能够和细胞膜上的APN3相互结合，主要结合部位为P74羧基端。P74 C端（321-580）既能与APN3在体外相互结合，也能与表达在细胞膜表面的APN3胞外区结合。但是P74全长蛋白和APN3相互结合并不能导致P74蛋白进入细胞和介导ODV感染离体细胞，表明宿主昆虫中肠细胞表明还有其他特殊的构造参与介导ODV侵入中肠细胞。筛选了2对针对APN3的双链RNA产物，注射进入幼虫血腔，能够有效地抑制家蚕幼虫中APN3的表达，但是通过口服喂食方式喂食3龄幼虫时，dsRNA干涉效果不佳。用野生型BMNPV口服感染经注射dsRNA干涉后的家蚕幼虫，结果表明其感染力显著下降，说明干扰APN3能够抑制包涵体感染,APN3在昆虫杆状病毒口服感染中起到重要作用。使用IE2启动子驱动的RNAI干扰载体来构建针对APN3转基因家蚕、其抑制效果不佳，需要选用中肠特性性启动子构建更加高效的转基因RNAi家蚕或者使用CRISPR/Cas9基因编辑系统来对目标APN3进行切除，以确定APN3在彻底失活后对ODV入侵的影响，同时也能证明APN3是否是ODV入侵结合的唯一因子。本研究基本上阐述了清楚了家蚕杆状病毒包涵体感染宿主中肠过程中P74蛋白和APN3相互作用的方式及其介导感染的关键作用，对进一步阐明杆状病毒口服感染宿主的分子机理具有重要的科学意义。如果能够通过基因编辑技术彻底敲除APN3基因，在分子育种中有望培养出抗杆状病毒感染的家蚕新品种，具有潜在的应用价值。项目已发表论文8篇，含SCI/EI 论文4篇，核心期刊5篇，授权专利8项。培养副教授3名，省厅级学术带头人1名，硕士研究生8名，更多研究成果将在1-2年内陆续发表。