集空间融解曲线分析的芯片基微流控梯度PCR新方法与技术研究

本课题针对目前高通量微流控PCR芯片技术缺陷及其应用的难点和瓶颈，以申请者前期研究成果为基础，研究一种通量高、反应和分析速度快、样品体积小甚至可调的、集空间融解曲线分析的芯片基微流控梯度PCR新方法与技术。以食品致病菌为研究对象，围绕芯片上多个不同基因片段平行的、高效率的、高特异性的扩增和检测，或者单一基因片段快速扩增优化展开基础和应用研究。微泵技术的高通量和相对独立控制保证本研究中微流控梯度PCR有效灵活，其灵活程度超过传统梯度PCR（开发的微流控梯度PCR能独立控制每个反应体系），从而满足不同用户需求。另外，和传统梯度PCR相比，灵活的空间温度梯度使研究的微流控梯度PCR具有更宽的温度梯度范围，从而应用范围更广、更灵活。本研究最终建立具有适用价值的、性能稳定可靠的、可快速检测的集空间融解曲线分析的芯片基微流控梯度PCR的新方法与技术平台。本项目的成功具有重要的科学意义和潜在的应用前景。

本项目属于结合光学、生物医学、电子学、流体力学等多个学科的交叉新兴技术，开展了集成化的连续流动PCR微流控分析技术。通过该项目的初步研究，在以下几个方面已经取得了一些进展：（1）首次报道了振荡流多元PCR的研究（在单一反应通道，样品为食源致病菌的纯化DNA样品）；报道了多通道振荡流多元PCR高通量、快速检测多个食源致病菌（在多个微通道中，样品为直接从被多个食源致病菌感染的食品中提取的DNA样品）。在这个基础上，研究组正开展振荡流多元梯度PCR的研究；（2）首次将柱面上连续流动PCR、微池静态RNA反转录以及在线荧光检测集成起来快速检测食源或水源致病性病毒，进一步提高食品致病菌核酸样品的分析速度；（3）首次提出了单相连续流动巢式PCR （SP-CF-NPCR）技术，该技术能快速、高灵敏度检测食源性致病菌；（4）开展了片状流多元PCR技术快速、高通量检测多个食源性致病菌（在单个连续流动反应通道中，实现传统多元PCR和片状流PCR的有机集成）。在这个基础上，研究组正进行集空间融解曲线分析的连续流动多元PCR微流控技术的开发研究。总之，在本项目的资助下，通过一些关联性的创新研究，已建成一套基于集成化微流控技术的食品致病菌高通量、高灵敏度核酸快速分析的技术平台。