基于人参发根的人参皂苷生物合成机理研究

人参是重要的经济性药用植物，研究表明人参的主要活性物质为人参皂苷。利用代谢工程手段调控人参皂苷的生物合成，提高栽培人参或培养物中皂苷含量在利用上具有重要意义。而目前，人们对人参皂苷生物合成机理的研究尚处在初期阶段，推测的人参皂苷合成途径也存在一些不确定点，阻碍了人参皂苷生物合成研究的深入和皂苷合成的代谢调控。本项目以人参发根为材料，采用RNA干扰和同位素示踪相结合的研究手段，对目前人参皂苷生物合成途径存在的主要不确定问题（途径、前体、分支）进行较系统的研究。首先利用同位素示踪技术确定人参皂苷合成是否存在MEP途径的问题；然后，通过标记可能的前体物，确定人参皂苷合成的直接前体；同时，利用RNA干扰技术，通过干扰处于皂苷和固醇合成分支点上酶（CS、DS、LS、βAS）的基因，研究其与人参皂苷合成的关系，确定哪些是皂苷合成的关键酶以及关键分支。为人参皂苷生物合成机制的深入研究和代谢调控奠定基础

人参的主要活性物质为人参皂苷。利用代谢工程手段调控人参皂苷的生物合成，提高人参或培养物中皂苷含量在理论和应用上都具有重要意义。目前人们对人参皂苷合成机理的研究尚处在初期阶段，推测的人参皂苷合成机理存在一些不确定点，其中有三个问题急待解决。（1）人参皂苷的合成是否存在MEP途径，目前还没有相关的研究报道，人参皂苷是经MVA途径还是MEP途径合成的，还是两条途径兼有？对于准确理解人参皂苷合成和调控具有重要意义；（2）人参的2,3-氧化角鲨烯是分四条支路，还是三条支路流向固醇和皂苷类物质的问题，决定着利用代谢工程调控人参皂苷合成的关键支路和关键酶的取舍；（3）目前尚无实验证据证明人参固醇和皂苷的前体是角鲨烯，而只是基于分子结构式的推测，明确人参皂苷生物合成的直接前体，是开展代谢调控研究的前提。.本项目以人参发根为材料，采用RNAi和代谢途径关键酶抑制剂阻断技术相结合的研究手段，对目前人参皂苷生物合成存在的上述不确定问题（途径、支路、前体）进行了较系统的研究，得到了较理想的答案。主要结果如下：.（1）通过MVA和MEP途径特异性拟制剂对人参皂苷合成影响的研究，确定了人参皂苷生物合成同时存在MVA和MEP途径.通过向培养基中分别添加MVA途径的抑制剂洛伐他汀和MEP途径的抑制剂膦胺霉素，检测人参发根总皂苷和单体皂苷含量，发现洛伐他汀对人参总皂苷含量的最高抑制率为57.94%，膦胺霉素对人参总皂苷含量的最高抑制率为42.17%；两种抑制剂对人参单体皂苷的抑制率与其对人参总皂苷含量的影响规律基本一致，说明人参皂苷的合成同时存在MVA和MEP途径，并推测MVA途径在人参皂苷的生物合成中起主导作用。.（2）利用RNAi技术确定了人参体内的2,3-氧化角鲨烯经四个分支流向固醇和皂苷.采用重组PCR技术构建CS、LS、DS和βAS基因的RNRi植物表达载体，经遗传转化人参外植体，得到上述4个基因被干扰的人参发根，通过研究CS、LS、DS和βAS基因的干扰对产物合成的影响，确定了人参固醇源于环阿乔醇和羊毛固醇；DS与βAS分别是经由2,3-氧化角鲨烯合成达玛烷型皂苷和齐墩果烷型皂苷两个支路上的关键酶基因。.（3）通过MVA和MEP途径特异性拟制剂对人参皂苷和固醇合成影响的研究，确定角鲨烯是人参皂苷和固醇的共同前体；酵母异源表达鉴定结果明确了人参皂苷生物合成的直接前体是达玛烯二醇。