植物赤霉素糖基化修饰分子机制研究

生物合成和代谢对赤霉素活性的调控作用已了解的比较清楚，但在植物界广泛存在的赤霉素糖基化修饰对赤霉素活性有何作用？糖基化修饰能否调控以及如何调控赤霉素的活性并进而影响植物的生长发育? 这些一直是赤霉素研究领域多年来悬而未决的科学问题。本项目以模式植物拟南芥为材料，试图首先鉴定和克隆赤霉素糖基化关键酶基因，然后通过基因过表达、基因敲除等反向遗传学手段来操纵赤霉素糖基化水平，进而研究糖基化对植物体内赤霉素的活性水平、赤霉素合成与代谢基因的表达、赤霉素信号转导以及对植物体生长发育的影响，从而了解赤霉素糖基化修饰在维持赤霉素活性的动态平衡以及发挥生物学效应的复杂分子机制。本研究从糖基化修饰这一新的视角来揭示赤霉素代谢调节及平衡机制，对于全面掌握赤霉素调控植物生长发育的基本规律具有重要科学意义。

通过三年的研究工作，已经从拟南芥糖基转移酶家族1中克隆了近40个基因。这些基因包括受赤霉素诱导的11个糖基转移酶基因、与赤霉素结构类似物甜菊醇的糖基转移酶基因序列一致性较高的13个基因、以及家族1中的其他20个基因。从国际拟南芥种子中心购买了40多个糖基转移酶基因的突变体，目前已全部鉴定出突变体纯合体。发现其中一个突变体（UGT87A2突变体）表现出晚花表型。但对该糖基转移酶进行酶活性检验时，该酶并不能糖基化修饰赤霉素。进一步的研究发现，该酶通过某种方式显著上调了开花抑制基因FLC的表达，相应导致了开花促进因子SOC1、FT、LFY、AP1等基因的下调，因而引起植物晚开花，该项研究的结果已经发表在New Phytologist (2012)。将以上克隆的40多个基因全部构建成了原核表达载体，然后在大肠杆菌中进行诱导表达。经过蛋白纯化，目前已经获得了30多个基因的酶蛋白。初步建立并优化了针对赤霉素等激素的酶促反应条件和HPLC分析条件，利用纯化的这些酶蛋白对赤霉素、生长素等激素进行了广泛的酶活性筛选。由于本项目的探索性很强，要筛选的糖基转移酶基因数量庞大，虽然经过艰苦的研究和大量的酶活性筛选，但目前在现有的酶中仍未发现针对赤霉素的糖基转移酶。然而，在项目执行过程了发现了一个新的生长素糖基转移酶基因UGT1。糖基转移酶UGT1能够催化IAA、IBA、IPA等生长素发生糖基化。通过比较不同生长素的转化率，发现该酶催化生长素糖基化的效率由高到低依次为IBA、IPA、IAA、NAA、2,4-D、ICA。获得了UGT1基因的过表达体和T-DNA插入突变体，结果发现该基因的过表达显著降低了拟南芥叶柄的角度，并造成叶子的卷曲。另外，UGT1突变体的根对外源生长素的抑制作用更加敏感，而过表达体相对不敏感。实验说明糖基转移酶UGT1在细胞内可能通过糖基化修饰造成了生长素的失活，该糖基转移酶在调节植物对生长素的反应方面有重要作用。依托本项目对植物糖基转移酶基因的研究结果，已经发表了影响因子为6.0以上（New Phytol）、5.0以上 (J Exp Bot)、4.0以上 (Plant Cell Physiol) 和3.0以上 (Planta) 四篇论文。该研究工作为继续鉴定和最终发现赤霉素的糖基转移酶基因奠定了基础。