反微透析技术下肝微环境内肝细胞生长因子信号通路在骨髓间充质干细胞诱导分化中的作用的实验研究

在骨髓间充质干细胞治疗肝纤维化的研究中，移植的干细胞是如期转分化为正常肝细胞还是反而诱导成为肝纤维化的前体细胞，现存较大争议。课题在原有基础上及理论推导选择肝细胞生长因子/c-Met信号通路作为肝微环境内间充质干细胞诱导研究的切入点，假定肝细胞生长因子/c-Met信号改变是造成体内诱导干细胞不同方向的核心因素之一，提出不同肝细胞生长因子浓度、相异作用时机及c-Met表达水平可能是诱导干细胞不同分化结果重要决定条件的假说。实验采用反微透析技术活体上精确给予鼠肝纤维化模型不同条件下肝细胞生长因子来析因分析其对干细胞的诱导分化之影响，从点到线进而全面突破探索活体肝脏中骨髓间充质干细胞移植的适宜微环境，以期指导临床有效的应用干细胞。课题选用较新颖的R2*map示踪磁共振显像技术监测超顺磁性氧化铁标记的干细胞移植后在肝微环境下分布及归巢情况，将活体标记细胞的分子影像学研究向前推进了一步。

课题依据预定计划和假说，遵循实验流程和方案，从培养纯化骨髓间充质干细胞（BMSCs）开始，选用了合作单位研制的含正电荷的超顺磁性氧化铁（SPIO），先体外标记干细胞，然后将标记的BMSCs成功的经肠系膜静脉注入大鼠肝内，以3.0T MR R2*map 技术可清晰显像，证实了MR分子示踪技术在干细胞活体监测的可行性。同时新型的SPIO标记容易，细胞毒性小，在MR上信号良好，具备成为一种新对比剂的潜能。此外干细胞诱导过程中试用了新合成的PLGA纳米纤维，其可以不添加诱导因子而直接使BMSCs向成骨方向分化，可以考虑开发成骨骼再生的支架，在组织工程学方面有较大意义。课题对比培养了脂肪干细胞（ADSCs）的体内成像，结果发现MR虽然可以成像，但随着时间的推移，比如实验注射大鼠跟踪了40天后，SPIO图像信号逐渐遗失，达不到文献所报道的18个周，分析原因可能与干细胞在体内的分裂以及上皮-间质转化(EMT)机制有关。. 课题组在大鼠肝纤维化模型使用微透析取样肝细胞生长因子（HGF）时遇到了超滤的问题，经反复实验加用中分子右旋糖酐有效解决了该问题。鉴于微透析在诸如蛋白质等物质应用的前景，课题组尝试与相关新材料组协同，制作一种特殊的再生纤维素半透膜材料，可以取样100-200KD的高分子物质，以求填补国内外大分子透析的空白。在反透析技术给予大鼠肝脏活体补充HGF进行验证假说的过程中，发现正常大鼠上给予HGF确实呈相关关系，但造模后肝纤维化的大鼠差别显著。经重复多次试验认为需要考虑肝实质损伤的轻重程度以及EMT机制对移植干细胞的影响。目前课题组比较肯定的是受损肝实质内移植干细胞诱导分化具有的多向复杂性，在其中HGF/c-Met信号通路处于重要环节。下一步研究的重点需要加入肝损伤程度差别以及EMT机制导致细胞表型的改变等因素，拟后续实验进行深入阐明。