基于广谱性抗体的兽药多残留免疫分析研究

养殖业中兽药的广泛应用甚至不规范应用，造成了动物源食品中兽药残留的多样化和复杂性，给监控工作带来了极大挑战。研究建立可同时检测同类或不同类多种兽药残留的免疫分析技术是解决这一问题的有效途径，而兽药多残留快速免疫分析技术的突破有赖于兽药分子广谱性抗体的获得。围绕上述问题，本项目拟选用磺胺类、喹诺酮类等兽药，确定同类兽药分子的共有抗原决定簇；通过兽药分子结构改造，获得最佳半抗原；研制出广谱性单克隆抗体和天然基因重组抗体；建立兽药分子-抗体的定量构效关系（QSAR）以评价广谱性抗体的亲和力和特异性；应用QSAR、氨基酸序列对比和蛋白质同源模拟技术，建立兽药分子-抗体互作虚拟模型，以指导天然基因重组抗体结构改造，获得改良的广谱性重组抗体；建立灵敏度高、检测谱广的量子点荧光、荧光偏振和化学发光等兽药多残留快速免疫分析检测技术，为我国动物源食品中兽药残留检测提供理论依据和技术保障。

设计合成了磺胺类、大环内酯类和β-兴奋剂类等兽药半抗原23种，筛选出最佳半抗原7种。制备出上述兽药的广谱性单克隆抗体和重组抗体9种，其中单克隆抗体4D11可以识别22种磺胺类药物，重组抗体anti-NOR scFv可以识别17种喹诺酮类药物。建立了基于广谱性抗体的磺胺类和阿维菌素的多残留快速检测ELISA法、喹诺酮类药物的多残留快速检测荧光偏振免疫分析法和基于喹诺酮类药物基因重组抗体的化学发光免疫法各1个；建立了基于多元标记的免疫分析检测技术3个，包括辣根过氧化物酶、量子点标记的可同时检测磺胺类、喹诺酮类和三聚氰胺的杂合免疫分析技术、四种荧光素标记的可同时检测磺胺类、喹诺酮类、链霉素和头孢氨苄的荧光偏振免疫分析技术和辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记的可同时检测磺胺类和喹诺酮类药物的双显色ELISA技术，上述方法的灵敏度和稳定性均达到了动物源性食品中兽药残留的检测要求。同时，研究了磺胺类和喹诺酮类抗体与抗原的分子识别机制，建立了抗原-抗体结合的定量构效关系模型和互作虚拟模型，根据获得的相互作用力类型和作用关键位点，指导了喹诺酮类药物单链抗体的定点突变，获得的突变体对沙拉沙星和二氟沙星的亲和力提高了10倍。