基于基因芯片技术的砂梨品种S基因型鉴定及S基因资源挖掘与进化分析

Pear is world fruit trees with self-incompatibility of gametophyte, which is controlled by single locus and S multiple alleles genes.To guarantee normal pollination and fertilization, different S genotype varieties have to be disposed in pear cultivation, so that success of high and steady yield , and breeding of pears can be achieved. Sand pear is the main growing fruit in southern China, which has more than 1000 varieties. Among 40 of them, S genotype has been ensured, while further studies on the identification of S multiple alleles genes and its sequence analysis are still needed. Present S genotype identification of pear varieties requires an enormous investment and complicated technology, and it's time-consuming. According to S multiple alleles genes of pear varieties in China, by means of 3'RACE technology, identified cDNA and gene group sequence of 47 S genes are to be cloned, and oligonucleotide microarray and cDNA chips for detection of S gene are to be made.Based on the hybridization of ecological varieties and chips, genetypes of pear varieties and unknown S genes are to be found . Analyses on cloning, sequence and homology of the selected unknown S genes are to be done.The research project is to make a thorough investigation of S gene resources of sand pear, identify S genetypes of pear varieties and make evolutionary analysis of S genes .The research result of the project is to provide an important scientific basis for the innovation and high-yield cultivation of sand pears and other kinds of pears in China.

梨是配子体自交不亲和世界性果树，其自交不亲和性由单一位点S复等位基因控制。梨栽培中必须配置S基因型不同品种来保证正常授粉受精，以达到丰产稳产和育种成功。砂梨是我国南方梨主栽品系，有1千多个品种，目前只有40多个品种S基因型已被确定，还有丰富的S复等位基因的鉴定和序列分析研究有待深入。现有鉴定梨品种S基因型的技术工作量大、花费时间长、成本高，短期内不能完成。本项目将针对我国梨品种S复等位基因存在情况，利用3'RACE技术克隆出已鉴定的47个S基因的cDNA和基因组序列，制作梨S基因寡核苷酸检测芯片和cDNA芯片，利用芯片与砂梨不同生态型品种杂交，确定各品种基因型并发现未知的S基因；对筛选出的未知S基因进行分离克隆、测序和同源性分析。本项目研究将基本查清砂梨品种S基因资源，鉴定出各品种S基因型，进行S基因进化分析。项目研究成果将为我国南方砂梨及其他品系梨品种创新及丰产栽培提供重要的科学依据。

梨是典型的配子体自交不亲和植物。砂梨是我国南方梨主栽品系。为满足梨栽培过程中授粉品种的准确配置和育种过程中亲本的合理选择，项目组进行了基于基因芯片技术的砂梨品种S基因 (S-RNase)资源挖掘与进化分析的系统研究。项目的主要研究工作与创新性成果如下：. ⑴ 研制了梨S基因寡核苷酸芯片和cDNA芯片。根据存在于东方梨中已知S基因序列特征及结构特点，设计了Tm值接近、长度均一的特异Oligo探针，研制了S基因寡核苷酸芯片；以S基因包含HV区的PF-PR cDNA序列作为cDNA探针，研制了S基因cDNA检测芯片；建立了S基因芯片检测系统。同时对新挖掘的S基因序列设计和制备探针，对芯片检测系统不断补充完善。利用两种芯片并行检测梨品种S基因，实现了利用S基因芯片检测系统快速检测梨品种S基因的准确性和可靠性。. ⑵ 利用S基因芯片检测系统完成了对砂梨不同种质资源S基因型的鉴定。 成功鉴定了473份砂梨品种所含S基因，优化后的S基因芯片检测系统能成功鉴定出砂梨品种所含已知S基因资源，同时根据芯片杂交信号可推测品种中新S基因存在。. ⑶ 分离和鉴定了砂梨31个新S等位基因。辅以酶切和DNA测序，从27个砂梨品种中分离获得了PpS18(P.Pyrifolia S18)、PpS18a、PpS47 ~ PpS66等31个新S基因序列；通过酶切位点分析，确定了能够切割砂梨22个新S等位基因的13种限制性内切酶。 . ⑷ 确定了砂梨4个S等位基因的基因组和cDNA全长序列。从砂梨品种嫩叶和雌蕊中成功克隆获得PpS37、PpS44、PpS47、PpS51等4个S-RNase的基因组全长和cDNA全长，均已登录到GenBank数据库。. ⑸ 对砂梨品种S基因资源及新S基因分子进化进行了系统分析研究。系统研究了砂梨S基因的序列多态性和分子进化关系，确定了我国砂梨品种S基因的种类及分布，S基因的进化模式和砂梨品种S基因间及与蔷薇科其它植物S基因间的进化关系。. ⑹ 完善了梨S基因鉴定的技术体系。通过梨S基因芯片检测系统的建立和砂梨22个新S基因13种限制性内切酶的确定，完善了梨S基因鉴定和S基因资源研究的技术体系，为梨丰产栽培和新品种的选育奠定了科学基础。