去极化诱导成年小鼠交感神经节细胞内钙缓慢升高的机制及功能研究

Skeletal myotubes have previously been shown to exhibit DHPR-G-PLC-IP3-IP3R-mediated, slow increases in intracellular calcium ([Ca2+]i) in response to membrane depolarization in the absence of external Ca2+, which participated in gene expression and transcription. However, the relationship between depolarization and Ca2+ increase in postganglionic sympathetic neurons is poorly studied. Our findings provide the first evidence of the existence of a depolarization-induced, Ca2+ influx-independent, intracellular Ca2+ release mechanism mediated by the activity of IP3 receptors in adult sympathetic neurons. Based on the above results, laser scanning confocal microscopy, whole cell patch-clamp technique, Western blot and RT-PCR were applied to address the functional relations between membrane depolarization and G-IP3R pathway, and the expressions of c-jun and c-fos gene and protein. These studies will elucidate new mechanism about Ca2+ regulation of postganglionic sympathetic neurons, identify signal transduction system involved in Ca2+ regulation, and also clarity the relations between depolarization-induced Ca2+ slow release and gene expression and transcription in postganglionic sympathetic neurons from adult mice.

骨骼肌细胞中，在没有细胞外钙的情况下，去极化可以导致[Ca2+]i升高，缓慢升高与DHPR-G-PLC-IP3-IP3R途径有关，参与基因的表达和转录。关于去极化与交感神经节细胞内钙变化的研究，未见报道。我们前期工作表明，在小鼠交感神经节细胞中存在一种类似骨骼肌细胞中的细胞内钙释放现象，在没有细胞外钙存在的情况下，去极化可以导致小鼠交感神经节[Ca2+]i缓慢升高，这种增高的细胞内Ca2+来源于细胞内钙库，与IP3R的激活有关。本课题拟在现有工作的基础上，采用共聚焦技术、膜片钳技术、Western blot、RT-PCR等方法对细胞膜去极化与G蛋白-IP3R通路的功能性关系以及c-jun和c-fos基因和蛋白的表达进行深入研究，阐明交感神经节细胞内钙调控的新机制，明确参与细胞内钙调控的信号转导系统，初步阐明去极化诱导小鼠交感神经节细胞内钙缓慢升高与基因表达及转录的关系。

据文献报道，骨骼肌细胞中，在细胞外无钙的情况下，去极化可以导致[Ca2+]i升高，缓慢升高与DHPR-G-PLC-IP3-IP3R途径有关，参与基因的表达和转录。另有文献报道，在细胞外无钙的情况下，多种神经细胞中也存在着细胞膜去极化可以导致[Ca2+]i升高的现象。关于膜的去极化与交感神经节细胞内钙变化的研究，以及与基因的表达和转录的关系，未见报道。本实验采用共聚焦、膜片钳、western blot、实时定量PCR等方法对细胞膜去极化与[Ca2+]i升高的关系以及与ERK1/2、CREB、c-Jun和c-Fos基因和蛋白的表达关系进行了研究。结果显示：（1）在细胞外无钙的情况下，高K+去极化可以诱导小鼠交感神经节细胞[Ca2+]i升高，细胞内钙变化的动力学与有钙液中不同，这种差异不是由膜的去极化差异所导致的，而是与钙通道的特性不同有关。（2）在细胞外无钙的情况下，高K+去极化诱导的细胞内钙变化与电压门控性钙通道激活特性无关，与电压门控性钙通道的稳态活性有关。（3）在细胞外无钙的情况下，高K+去极化诱导的[Ca2+]i升高来源于细胞内钙库，与RyR无关，与IP3R的激活有关。（4）在细胞外无钙的情况下，高K+去极化诱导的细胞内钙增高与细胞膜L型钙通道无关。（5）在细胞外无钙的情况下，高K+去极化诱导的细胞内钙增高，与Na+和/或K+内流无关。（6）在细胞外无钙的情况下，高K+去极化可以使ERK1/2、CREB、c-Jun和c-Fos基因和蛋白的表达均增加。（7）在细胞外无钙的情况下，阻断IP3R、PKC和ERK1/2可以抑制ERK1/2、CREB、c-Jun和c-Fos基因和蛋白的表达。（8）在细胞外无钙的情况下，阻断N型钙通道、钠通道、G蛋白和PLC对ERK1/2、CREB、c-Jun和c-Fos基因和蛋白的表达没有影响。以上结果说明，在细胞外无钙的情况下，高K+去极化可以诱导成年小鼠交感神经节细胞内Ca2+升高，增高的细胞内Ca2+来源于细胞内钙库，与IP3R的激活有关，与RyR、L型钙通道、DHPR-G-PLC通路、钠通道无关；在细胞外无钙的情况下，高K+去极化诱导的[Ca2+]i增高，与交感神经节细胞基因的表达与转录有关，其中IP3R、PKC和ERK1/2参与了交感神经节细胞基因的表达与转录，N型钙通道、钠通道、G蛋白和PLC与这种作用无关。