调节猪免疫功能的关键硒蛋白的探寻及其表达的调控机制

It has been confirmed that selenium at the nutritional levels or slightly higher than the nutritional levels plays an important role in the regulation of immunity in pigs, especially in the cellular immunity. The physiological functions of selenium are largely due to the presence of selenoproteins. Now more than 20 selenoproteins have been identified, but it's still not clear which selenoproteins play a key role in the regulation of immunity in pigs and how the selenoprotein expression are modulated by selenium status. The present project will investigate the effects of selenium on the pig immune function and its relationships to the selenoprotein expressions and seek the key selenoproteins on the regulation of immunity induced by selenium by using CFSE labeling and flow cytometry (evaluating T lymphocytes proliferation stimulated with anti-pig CD3 mAb), ELISA (cytokines assay), Real-time PCR, Western Blot （seleniprotein expression assay）and RNAi technologies in vitro and in vivo. The changes of some related genes after up or down-regulation of the selenoprotein expressions and the possible involved signaling pathways also will be studies by using RNAi and gene chip technologies. The aim of this project is to elucidate the molecular mechanism of immune regulation induced by selenium in pigs, to give an evidence for the application of some specific selenoproteins as a biomarker in development of a new selenium-source additive and to provide a scientific basis for the application of selenoproteins on animal husbandry (e.g. a new immuno-adjuvant).

研究证实，营养水平或稍高于营养水平的硒具有显著调节猪免疫特别是细胞免疫的作用。硒蛋白是硒在体内发挥生物学功能的主要形式，已确定的硒蛋白有20余种。但究竟哪些硒蛋白在猪免疫调节中起关键作用？硒蛋白的表达是如何调控的？尚未见研究。本项目主要是通过猪原代淋巴细胞培养和仔猪试验，应用CFSE示踪和流式细胞术等方法检测T淋巴细胞增殖（用抗猪CD3单抗等刺激）、ELISA检测细胞因子、荧光定量PCR和Western Blot检测硒蛋白表达并结合RNA干扰技术，研究硒、猪免疫功能与硒蛋白基因表达或沉默的相互关系，探寻调节猪免疫功能的关键硒蛋白；应用RNA干扰和基因芯片技术研究上调或下调硒蛋白基因的表达会导致哪些相关基因发生变化，筛选与硒蛋白基因相互作用的基因及可能的信号通路。目的是阐明硒调节猪免疫的分子机理，为新型硒源饲料添加剂的研制提供标示硒蛋白，同时为硒蛋白的开发利用（如新型免疫佐剂）提供科学依据。

研究证实，一些霉菌毒素，如黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A能抑制猪的免疫功能，营养水平或稍高于营养水平的硒具有显著调节猪免疫特别是细胞免疫的作用。硒蛋白是硒在体内发挥生物学功能的主要形式，已确定的硒蛋白有20余种。但究竟哪些硒蛋白在猪免疫调节尤其是在减轻霉菌毒素的免疫毒性中起关键作用？如何利用硒蛋白的免疫调节特性应用于猪病防控？尚未见研究。本项目通过猪原代T淋巴细胞和PK15细胞培养以及仔猪试验，应用CFSE示踪和流式细胞术等方法检测T淋巴细胞增殖（用抗猪CD3单抗等刺激）和细胞凋亡、ELISA检测细胞因子、荧光定量PCR和Western Blot检测硒蛋白表达并结合RNA干扰技术，研究了硒、霉菌毒素毒性、猪免疫功能与硒蛋白基因表达或沉默的相互关系。首次证明硒蛋氨酸比无机硒更能有效调节猪淋巴细胞免疫功能，而硒调节受抑淋巴细胞免疫功能的效果比正常淋巴细胞更显著。硒对不同硒蛋白的调控作用并不相同，日粮中硒水平的改变对淋巴细胞GPx1 mRNA和蛋白的表达影响最大，对TR1的表达影响次之，而对于GPx4的表达几乎没有影响。首次证明，硒蛋氨酸能显著减轻黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A引起的免疫毒性，其中GPx1和硒蛋白s起了关键性的作用，并从信号通路方面阐明了机制。确定GPx1是硒调节猪免疫的最关键硒蛋白，为硒蛋白的开发应用提供了科学依据。首次构建出含有猪GPx1基因的质粒，标记为pcDNA3.1-GPx1，成功构建了猪肾细胞GPx1过表达细胞系。以pcDNA3.1- GPx1为模板扩增出GPx1，依次将GPx1和LSynORF5连入真核表达质粒pcDNA3.1中，将质粒pcDNA3.1- GPx1-LSynORF5瞬时转染Vero细胞，获得了大小约为50KDa的融合蛋白，证明其具有良好的免疫原性。试验表明，pcDNA3.1-GPx1-LSynORF5在小鼠和猪体内比pcDNA3.1-SynORF5能诱导更好的体液和细胞免疫应答，一定程度上提高了对小鼠和仔猪的攻毒保护，为PRRSV新型疫苗的研制提供了新的思路。