H9N2亚型禽流感病毒抗原性进化的分子机制及高级抗原特性毒株的免疫反应特性研究

H9N2 avian influenza virus has been circulating in different types of terrestrial poultry in china, resulting in great economic losses due to frequently antigenic drift. So far, some H9N2 avian-origin isolates have acquired human–like mutations and might become more dangerous and lead to human-to-human transmission if they further adapt in mammalian host or reassort with other influenza viruses. Therefore, H9N2 influenza virus is posing a critical threat to public health. In this study, to thoroughly understand the antigenic characterization and evolution of H9N2 influenza viruses in China and also recommend antigenic-matched vaccine strains, cross-HI assay and antigenic cartography will be employed to construct the H9N2 antigenic map. Next, we ask where the evolution directions of H9N2 influenza viruses are, and can we predict it? To address these questions, we will introduce random mutations into the globular head of HA genes of the represent strains of each clade which are identified in our antigenic map by error-prone PCR to construct random mutant plasmid libraries, we then generate random mutant virus libraries by reverse genetics and select antigenic escape mutations by incubating the virus libraries with ferret convalescent sera to H9N2 vaccine viruses. Then we analyze the antigenic properties of escape mutations by using HI assay and antigenic cartography to predict the antigenic evolution of H9N2 influenza viruses. Furthermore, we select the antigenically advanced viruses, and also design computationally optimized broadly reactive antigen (COBRA) recombinant viruses according to the antigenic escape mutants map, and then evaluate potential values and prospect of these recombinant viruses as advanced and broadly vaccine viruses. The implementation of the project will deepen the scientific understanding on the molecular basis of antigenic evolution of H9N2 viruses, and will provide new idea of influenza vaccine design and influenza epidemic and pandemic control.

H9N2亚型禽流感病毒在我国广泛流行、抗原变异复杂，给该亚型病毒的防控带来了巨大困难。目前部分H9N2禽流感病毒已经获得人流感病毒特征，如果继续发生变异很有可能在人群之间传播，对人类的健康威胁巨大。本研究通过系统研究我国H9N2禽流感病毒的抗原特征，绘制抗原图谱并重新定义抗原群，深度解析H9N2病毒之间的进化特征和抗原关系。针对不同抗原群的代表毒株，应用基因随机突变技术株构建HA基因抗原决定区随机突变病毒文库，筛选抗原逃逸突变，抗原作图法分析抗原逃逸突变的进化特征，结合自然界变异株的抗原特性确定我国H9N2病毒未来的抗原性进化方向。在此基础上，研制计算机优化的广谱反应抗原毒株和具高级抗原特性的突变毒株，对其免疫反应特性和作为广谱疫苗的可行性展开深入研究。本项目的实施将深化对H9N2病毒变异规律和未来进化方向的认知，为H9N2病毒广谱疫苗的设计和流感疫情的防控提供新思路和科学依据。

禽流感病毒（AIV）是危害禽类产业发展的主要病原体之一，其中H9N2 AIV在我国禽类中传播最为广泛，变异复杂，疫苗不能有效地控制该亚型病毒的流行与传播，对家禽养殖业造成严重的经济负担。而被确诊的H9N2 AIV直接感染人病例目前已超过63例，虽然尚未造成感染人致死的事件，但是病毒继续进化和变异，很有可能在人群之间水平传播，对人类的健康威胁巨大。本研究首先对流感病毒数据库中H9N2 AIVs HA基因，及从我国华东地区和南部各省市分离到H9N2 AIVs进行系统的遗传演化分析，发现目前我国流行的H9N2 AIVs仍然以9.4.25分支为主，随后通过交叉血凝抑制和抗原作图法分析发现目前在我国流行的H9主要分为3个抗原群，且动物实验表明一株H9N2病毒对小鼠呈高致死性。在此基础上以两株代表株A/CK/Jiangsu/75/2018 (JS/75)和A/JS/Jiangsu/76/2018 (JS/76)开展深入研究，发现HA的127、183和212位氨基酸可导致不同程度的抗原逃逸，r-76/PR8病毒制备的灭活疫苗对SPF鸡具有更好的交叉保护性，发现所测试的H9重组病毒具有双重受体亲和力，D127N突变可降低病毒与α-2, 6唾液酸受体的亲和力；细胞和动物实验表明，127位突变可改变病毒在A549细胞上的复制水平和对小鼠的致病性。同时揭示了HA的127、135、145和146位氨基酸突变可引起目前的H9N2疫苗免疫保护性下降，是导致2020年初在我国南方出现的H9N2新型变异株迅速在全国流行的关键。为有效的防控H9N2的流行，本研究研制了一株具有广泛交叉反应性的单抗，能够与8个亚型的流感病毒发生反应，并具有不同程度的中和能力，更重要的是该抗体对H9N2AIV感染的小鼠具有良好的预防和治疗效果。研制了一株高产H9N2疫苗候选株r-Fujian/11/2020，并研制出能够特异性的针对禽流感病毒（尤其是H9N2）具备高复制特征的敏感细胞系。筛选出A/CK/Changzhou/193/2019（H9N2），该毒株对H9的感染具有广泛的交叉保护性。本项目的开展对于深入揭示我国H9N2亚型禽流感病毒的进化和抗原变异规律及相关分子机制提供了重要数据支撑，对交叉反应性良好的疫苗和抗体的研制具有重要的指导意义。