调控玉米胚乳细胞分裂的ZmKRP基因筛选与功能分析

More endosperm cell numbers , faster the grain filling rate and heavier seed weight. During maize endosperm development, 3 Cyclin-dependent kinases (CDK) genes expressed in endosperm cell and their expression levels were stable, thus, the ZmCDKs inhibitors, ZmKRPs, might play important roles in the regulation of endosperm cell division. In the previous study, we found there are 8 zmKRP genes in maize genome, which belongs to 2 classes; Protein subcellular localization analysis in onion epidermal cells showed that all zmKRP proteins were located in the nucleus; RNA-seq and semi-quantity RT-PCR analysis showed 6 zmKRP genes were expressed in the developing maize endosperm. In this present project, we will analyze the kinase activity inhibition of ZmCDKs by zmKRPs to screen the candidate zmKRPs, and analyze the interactions between the candidate zmKRPs and ZmCDKs by yeast two-hybrid; Then, the maize endosperm development specifically expressed pbetl2 promoter was used to suppress the expression of zmKRPs by RNAi. Finally, the function and mechanism of zmKRP genes in maize endosperm cell division and filling rate regulation will be analyzed.

胚乳细胞数目越多，籽粒灌浆速率越快，粒重越重。玉米胚乳发育阶段有3个调控细胞分裂的细胞周期蛋白依赖性激酶CDK基因在胚乳中表达，且表达量基本恒定，因此 ZmCDK抑制因子ZmKRP在胚乳细胞分裂中可能起着重要作用。前期项目组在玉米全基因组搜索发现，玉米有8个zmKRP基因，分属于2个亚类；洋葱表皮亚细胞定位显示，8个zmKRP蛋白均定位于细胞核；转录组测序和半定量RT-PCR分析发现6个zmKRP基因在胚乳中表达。本项目将在此基础上在裂殖酵母中筛选抑制胚乳zmCDK激酶活性的zmKRP，通过酵母双杂交分析筛选的zmKRP与zmCDK的作用关系，然后用玉米胚乳发育时期特异表达pbetl2启动子通过RNAi抑制玉米胚乳发育时期zmKRP基因的表达，筛选调控玉米胚乳细胞数目和籽粒灌浆速率的zmKRP基因，解析zmKRP基因调控玉米胚乳细胞分裂、促进玉米灌浆的分子机制。

胚乳是作物种子的主要组成部分，胚乳细胞的大小和数目直接影响作物种子的大小及重量。真核生物细胞分裂受细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases，CDKs）的调控 ，周期蛋白依赖性激酶抑制因子 （inhibitors of Cyclin-dependent kinase，ICKs）调控CDK活性从而影响细胞分裂增殖。本项目通过玉米全基因组搜索，鉴定了8个ZmICKs家族成员，分别位于玉米的5条染色体上，基因结构分析将8个ZmICKs成员分为B和C两个亚类。表达模式分析发现有6个ZmICKs基因在胚乳中表达；洋葱表皮亚细胞定位显示，8个ZmICKs蛋白均定位于细胞核。酵母双杂交显示， C类4个ZmICK蛋白ZmICK1、ZmICK4、ZmICK6、ZmICK8与ZmCDKA1和ZmCDKA3相互作用，双分子荧光互补实验进一步证实了它们之间在细胞核内的互作关系。裂殖酵母系统分析发现4个C类ZmICK蛋白中ZmICK6和ZmICK8能在裂殖酵母中抑制ZmCDK1和ZmCDK3活性，因此ZmICK6和ZmICK8可能是调控玉米胚乳细胞发育的重要因子。我们进一步创制了玉米zmick6和zmick8纯合突变体，对纯合突变体籽粒和胚乳表型进行了鉴定，胚乳细胞切片显示，从5DAP开始突变体胚乳细胞比野生型大；籽粒大小比较发现，8DAP开始，突变体粒长比野生型长；成熟期籽粒粒长显著大于野生型，粒宽、粒厚无显著差异，百粒重极显著高于野生型；淀粉含量测定发现，zmick6和zmick8突变改变了胚乳淀粉积累峰值出现的时间，但成熟胚乳总淀粉含量无显著差异。本研究结果为分子育种手段增加玉米百粒重提供了参考。