基于冷冻溶剂模板技术的细胞高渗透性超细纤维体系制备及其对干细胞行为诱导机制研究

The compact structures of the conventional ultrafine fibrous scaffolds limit the infiltration of cells and can hardly emulate the three dimensional (3D) structures of extracellular matrices, and thus hinder the applications of the ultrafine fibers in tissue engineering and the investigation of stem cell behaviors when the cells are embedded in 3D ultrafine fibers. This project will develop 3D ultrafine fibrous scaffold with high cell infiltration via the frozen-solvent-templating method based on the study of the influence of solvent freeze on the fiber gaps. The applicant developed the gelatin ultrafine fibrous scaffolds with fiber gaps around 30 – 140 μm by the frozen-solvent-templating method, buy it was difficult to maintain the fiber gaps when the scaffolds were wetted. By the observation of the solvent freeze behaviors, this proposal aims to clarify the requirements to form fibrous scaffolds in a liquid-liquid phase separation/ solvent crystallization system and reveal the mechanism of the fiber gap controlling during the scaffold formation. The high-cell-infiltration 3D ultrafine fibrous scaffolds with fiber gaps around 30 - 200 μm at a wet state will be produced based on the fiber-gap-controlling mechanism and the development of fiber modification methods. Stem cell behaviors on the 3D ultrafine fibrous scaffolds will be studied. The accomplishment of this project will solve the problem of cell infiltration to ultrafine fibrous scaffolds and promote the development of tissue engineering scaffolds and the study on the stem cell behaviors.

传统超细纤维支架结构致密，细胞渗透差，难以实现对三维（3D）细胞外基质结构的模拟，因此制约超细纤维支架在组织工程领域的应用以及干细胞在超细纤维3D空间包覆培养状态下的细胞行为的研究。本项目拟在探索溶剂结晶行为与纤维间距关联的基础上，利用冷冻溶剂模板技术实现细胞高渗透性3D超细纤维支架的构筑。申请人已应用该技术成功制备纤维间距在30-140μm的明胶3D超细纤维支架，但湿态下无法保持最佳细胞渗透纤维间距。本项目中申请人拟通过原位考察溶剂结晶行为入手，确立液液分相复合溶剂结晶体系内成纤边界条件，探索超细纤维体系中纤维间距的调控理论，在提炼控制纤维间距关键因素及开发配套纤维改性处理技术的基础上，实现湿态下纤维间距可达30-200μm的细胞高渗透性3D超细纤维支架的构筑，进而揭示其形态结构特性对干细胞行为的诱导机制。本项目的顺利完成将可攻克超细纤维支架细胞渗透性难题，推进组织工程支架的

传统超细纤维支架结构致密，细胞渗透差，难以实现对三维（3D）细胞外基质结构的模拟。若构筑结构疏松的3D超细纤维体系，又会面临机械性能弱、水稳定性差、物质转运不足的问题，难以满足支架多功能化的应用需求。以上问题制约超细纤维支架在组织工程领域的应用以及对干细胞在超细纤维3D包覆培养状态下的细胞行为研究。. 本项目利用冷冻溶剂模板技术，详细探讨了调控3D超细纤维支架形态的关键因素，确立成纤边界条件，成功构筑超高比孔容3D超细纤维支架（265.5～554.6 cm3/g），纤维集合体比孔容相较二维（2D）静电纺体系提高30倍，实现细胞对超细纤维体系的深层渗透（> 235 μm）；通过干细胞培养，探讨了干细胞在超高比孔容3D超细纤维支架上的细胞行为，结果显示干细胞附着增加3.9倍，渗透深度增加超4.9倍，增殖提高4.5倍，证明该种支架对干细胞生长具有促进作用；结合先进三维织造技术，以三维织造结构基架，对体状超细纤维体系增强，使其压缩模量提升至16.77 kPa，满足压缩模量1.5 kPa的使用要求；为实现多尺度纤维复合均匀要求，在蛋白基超细纤维体系引入对活泼氢基团具有高反应活性的环氧化合物，实现蛋白基超细纤维的超高水稳定性（溶胀率1%）；通过嵌入具有半透膜特性的中空纤维，探索营养物质和代谢物质在3D支架中的转运行为，赋予3D支架血运功能，证明血运功能对细胞增殖有促进作用（提高68.8 %）；基于冷冻溶剂模板技术，探索了超低浓度溶液结晶行为与药物负载关系，在维持3D超细纤维形态下，实现功能分子超高负载（>20wt%）和长效控制释放（30天释放速率为1 wt%/天）。研究结果为攻克超细纤维支架细胞渗透性难题，提供了可行的解决方案，并在增强机械性能、水稳定性和增加血运功能、功能分子运载方面进行了初步尝试，为开发功能全面的超细纤维组织工程支架奠定基础。基于以上内容的研究，申请人发表SCI论文2篇，核心期刊论文2篇，会议论文8篇（均注明国家自然科学基金资助并标明资助号）。申请发明专利15项，授权9项。